Использование радиоактивных материалов (RAM) требует предварительного одобрения назначенного комитета по безопасности в каждом учреждении.
1. Поглощение аминокислот клетками
- Планшет 5 x 10по 4 клетки ST2 в каждой лунке 12-луночного планшета для культуры тканей. Пластинчатые клетки в α-MEM, содержащие 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 0,1 мкг/мл стрептомицина (Pen/Strep). Нанесите дополнительные лунки клеток для количественного определения количества клеток для каждого условия нормализации на шаге 1.12. Инкубируйте клетки в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур при 37 °C с 5%CO2.
- Культивируйте клетки в течение 2-3 дней до слияния.
- В день эксперимента приготовьте следующие растворы: 1x Фосфатно-солевой буфер (PBS), pH 7,4 и буфер Krebs Ringers HEPES (KRH), pH 8,0: (120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2, NaHCO3, 5 мМ HEPES, 1 мМ D-глюкоза). Разогреть до 37 °C.
- Аспирируйте среду и дважды промойте клетки 1 мл 1x PBS, pH 7,4.
заметка: Этот протокол также подходит для быстро делящихся несливных клеток. В этом случае важно нормализовать радиоактивность либо до абсолютного числа клеток, либо до содержания ДНК. Кроме того, рассмотрите возможность увеличения размера культуральной пластины или колбы, чтобы увеличить общее количество клеток и значения cpm. Это важно определить опытным путем в индивидуальном порядке.
- Отсадите 1x PBS и промойте клетки один раз 1 мл KRH.
- Приготовьте 4 мкКи/мл L-[3,4-3 H]-глутамина в рабочей среде, разбавив 4 мкл [1 μCi μL-1] L-[3,4-3 H]-глютамина на 1 мл KRH.
заметка: Перед использованием радиоактивных материалов обратитесь в Управление радиационной безопасности вашего учреждения для получения разрешений. Все процедуры, связанные с облучением, должны выполняться за плексигласовым экраном.
- Инкубировать клетки с 0,5 мл KRH, содержащей 4 μCi/мл L-[3,4-3 H]-глутамина рабочей среды, в течение 5 мин.
- Соберите радиоактивную среду и раздайте ее в контейнер для жидких отходов. Трижды кратковременно промойте клетки ледяным KRH, чтобы завершить реакцию. Соберите и выбросьте все смывки в контейнер для радиоактивных жидких отходов.
- Добавьте 1 мл 1% SDS в каждую лунку и растирайте 10 раз, чтобы лизировать и гомогенизировать клетки. Перенесите лизаты клеток в пробирки объемом 1,5 мл. Выбросьте планшеты для клеточных культур, серологические пипетки и наконечники для пипеток в контейнер для твердых радиоактивных отходов.
- Центрифугируйте при >10 000 x g в течение 10 мин. Переложите надосадочную жидкость в сцинтилляционные флаконы, содержащие 8 мл сцинтилляционного раствора. Перемешайте, энергично встряхивая сцинтилляционные флаконы. Выбросьте пробирки и наконечники для пипеток в контейнер для твердых радиоактивных отходов.
- Считывание радиоактивности в отсчетах в минуту (cpm) с помощью сцинтилляционного счетчика. Выбросьте сцинтилляционные флаконы в контейнер для отходов сцинтилляционных флаконов.
- Трипсинизировать, ресуспендировать и подсчитать клетки из оставшихся нерадиоактивных пластин клеток (см. шаг 1.1) для оценки количества клеток в лизированных радиоактивных культурах. С помощью гемоцитометра подсчитайте количество клеток в одной нерадиоактивной лунке для каждого экспериментального условия. Нормализуйте cpm с шага 1.11 до расчетного количества клеток из нерадиоактивных пластин.
- После завершения эксперимента обеззараживайте вытяжку для клеточных культур, стенд и все инструменты с помощью распыления радиоактивного обеззараживающего вещества. Наконец, проведите тесты на протирание, чтобы убедиться, что рабочая зона свободна от излучения.
