Колориметрический анализ для количественного определения лактата в исследуемых образцах

Аннотация

Источник: Yanase, S., et al. Мелкомасштабные колориметрические анализы внутриклеточного лактата и пирувата у нематоды Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает колориметрический анализ для измерения лактата в клеточных лизатах с использованием фермента лактатдегидрогеназы. Этот фермент превращает лактат в пируват, а также превращает NAD в NADH, который реагирует с красителями тетразолия и дает окрашенный продукт, который можно измерить спектрофотометрически для количественного определения лактата.

Протокол

1. Синхронизированная культура C. elegans

1. Перед посевом культивируют штамм Escherichia coli (E. coli) OP50 в течение ночи при 37 °C в 300 мл жидкой среды бульона Лурия-Бертани (LB). Храните культивированный OP50 при температуре -4 °C.
   1. Чтобы приготовить жидкую среду для бульона LB, используйте 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCl и 1,5 мл 1 N NaOH и добавьте в 1 л деионизированной воды. Autoclave.
      заметка: Штаммы OP50 и C. elegans можно приобрести в Центре генетики Caenorhabditis (Университет Миннесоты, Сент-Пол, Миннесота, США).
2. Для приготовления агара питательной среды для нематод (NGM) используйте 3 г NaCl, 2,5 г пептона, 17 г агара и 975 мл деионизированной воды. Автоклав. Охладите до 55 °C, затем стерильно добавьте по порядку 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 1 М CaCl₂, 1 мл 5 мг/мл холестерина в EtOH и 25 мл 1 М фосфата калия pH 6,0 в 90-мм чашках Петри.
   1. Для 1 М фосфата калия pH 6,0 используйте 108,3 г KH₂PO₄ и 46,6 г K₂HPO₄, а также добавьте деионизированную воду в 1 л автоклава.
3. Разложите 1-2 мл культивированного OP50 на агаровых пластинах NGM. Чтобы сделать тонкий слой OP50, инкубируйте пластины в течение ночи при комнатной температуре><, прежде чем добавлять любых нематод. заметка: Агаровые пластины NGM, инокулированные OP50, могут храниться при комнатной температуре в течение 2-3 недель.
4. Добавьте не менее 100 червей на планшет для агара NGM с OP50 и культивируйте при 20 °C до взрослой стадии. Требуется не менее трех тарелок.
5. Чтобы собрать яйца в утробе матери, перенесите гравидарных гермафродитов из трех агаровых пластин NGM с 5 мл S-буфера в 15-мл конической пробирки и промойте червей 3 раза 15 мл S-буфера с использованием центрифугирования при 300 x g в течение 30 с при комнатной температуре.
   1. Для приготовления S-буфера используйте 5,9 г NaCl и 50 мл 1 М калийфосфата pH 6,0, и добавьте к 1 л деионизированной воды. Автоклав.
6. Растворите червей в растворе щелочного гипохлорита для аксенизации и объемной изоляции яиц (0,5 мл свежего хлора или эквивалента: 5-6% гипохлорита натрия, 0,1 мл 10 М NaOH, примерно 4,5 мл S буфера) и выдержите раствор 10-15 мин при комнатной температуре с перемешиванием путем инвертирования.<бр/> заметка: В течение 15 мин взрослые черви должны раствориться, оставив из своих туш мутный раствор из яиц (освобожденные яйца следует подтвердить с помощью стереоскопического микроскопа). Вместо 0,1 мл 10 Н NaOH также можно использовать 0,2 мл 5 Н NaOH.
7. После обработки гипохлоритом яичную гранулу 3 раза промыть 15 мл S буфера, а затем повторно суспендировать в 5-6 мл S буфера. Вылупившиеся яйца вылупляются во время ночной инкубации при 20 °C в S-буфере без E. coli для получения синхронной по возрасту культуры личинок стадии L1.
8. Чтобы определить примерное количество личинок стадии L1, подсчитайте червей с помощью стереоскопического микроскопа в 10 мкл S буфера после ресуспензии личинок не менее 3 раз, и рассчитайте среднее значение. Затем перенесите личинок стадии L1 в пять агаровых пластин NGM с OP50 (1500-3000 червей на пластину с использованием 90-миллиметровой чашки Петри) и культивируйте при 20 °C до тех пор, пока они не вырастут до молодой взрослой стадии, когда начнется самооплодотворение и будет отложено несколько яиц (обычно через 3 дня).

2. Извлечение клеточной фракции из C. elegans

1. Соберите молодых взрослых особей (5-дневных животных) червей из пяти агаровых пластин NGM с S-буфером (рис. 1A).
   1. Чтобы отобрать только живых червей с помощью сахарозного метода 6 для флотации на 30% (мас./об.) сахарозе, смешайте червей, взвешенных в 3-4 мл S-буфера, с равным объемом ледяной 60% (мас./об.) сахарозы в конической пробирке объемом 15 мл. Вращайте пробирку при давлении 1 500 x g в течение 15 с при 4 °C и удалите плавающих червей в новую пробирку, переместив их со стенки пробирки с помощью пастеровской пипетки.
2. Промойте черви 3 раза с помощью S-буфера центрифугированием при давлении 1 500 x g в течение 30 с при 4 °C. Проверьте объем промытых червей после центрифугирования с помощью наконечника для микропипетки объемом 1 000 мкл (рис. 1B).
3. Добавьте промытых червей в равный объем ледяной 10% (w/v) трихлоруксусной кислоты (TCA; конечная концентрация 5%) для осаждения белка (рис. 1C). Вместо ТСА можно использовать хлорную кислоту (ПЦА) или метафосфорную кислоту.
4. Гомогенизируйте червей осадителем с помощью 40 взмахов пестика в тефлоновом гомогенизаторе (тканевый измельчитель Potter-Elvehjem) с вращением до 1 300 об/мин на льду.
5. Перенесите гомогенат в свежую микропробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки Пастера и окуните ультразвуком с помощью ультразвукового гомогенизатора в течение 3 мин (3 раза по 1 мин) с рабочим циклом 20% на льду.
6. Осветите гомогенат центрифугированием при 8 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Нейтрализуйте надосадочную жидкость с помощью 4 М KOH (от 0,25 об. до 10% ТСА) в течение 20 мин на льду и центрифугируйте при 8 000 x g в течение 10 мин при 4 °C. Надосадочная жидкость (в качестве исследуемого образца) может храниться при температуре -80 °C до проведения следующих анализов.

3. Анализ лактата с использованием колориметрического набора для анализа

1. Измерьте концентрацию лактата в исследуемых образцах с помощью набора для колориметрического анализа (Table of Materials). Проведение дуплексных исследований для исследуемых образцов. Добавьте 5 или 10 μL исследуемых образцов в 96-луночный планшет и отрегулируйте объем до 50 μL на лунку с помощью буфера для анализа лактата, входящего в комплект.
2. Для стандартной кривой лактата разбавьте 100 мМ л(+)-лактата стандартного до 1 мМ с помощью буфера для анализа лактата. Добавьте 0, 2, 4, 6, 8 и 10 μL стандарта лактата 1 мМ (+)-лактата, который входит в комплект, в ряд лунок.
3. Добавьте в каждую лунку 50 мкл реакционной смеси (содержащей 46:2:2 буфера для анализа лактата, смеси ферментов лактата и зонда лактата в безводном ДМСО; все реагенты поставляются в комплекте) или смеси для фонового контроля (содержащей 48:2 буфера для анализа лактата и зонда лактата) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30-60 минут, пока образцы защищены от света.
4. Измерьте поглощение каждой лунки на длине волны 570 нм с помощью считывателя микропланшетов и вычтите поглощение контрольной смеси фона из поглощения реакционной смеси.
5. Постройте стандартную кривую лактата. Рассчитайте концентрацию лактата в испытуемых образцах по стандартной кривой лактата.

Результаты

Рисунок 1. Процесс экстракции клеточных метаболитов. (А) 1500-3000 червей были помещены на агаровую пластину NGM (90-мм чашка Петри). Для проведения колориметрических анализов было достаточно экстракции из червей на пяти планшетах. (В) Черви, собранные с пяти пластин по 3000 и 1500 червей на пластине, указаны соответственно на левой и правой стороне ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Набор для колориметрического/флуориметрического анализа лактата	БиоВижн	#K607-100	колориметрический/флуориметрический 100 проб; Хранить при температуре -20°С
Трихлоруксусная кислота	Вако Пьюпер Химический	#207-04955	Хранить при комнатной температуре
Тефлоновый гомогенизатор	Иваки/Пайрекс	#358034 (Уитон)	Вместо Iwaki/Pyrex от Wheaton