Спектрофотометрический анализ для определения активности гликогенсинтазы

Аннотация

Источник: Уилсон В.А., Спектрофотометрические методы изучения метаболизма эукариотического гликогена. J. vis. Exp. (2021).

Это видео описывает спектрофотометрический анализ для оценки активности гликогенсинтазы. Метод основан на снижении абсорбции НАДН со временем и указывает на активность гликогенсинтазы.

Протокол

1. Определение активности гликогенсинтазы

1. Готовьте исходные растворы необходимых реагентов, как указано в таблице 1 (до дня эксперимента).
2. В день проведения анализа готовят свежий рабочий раствор 4 мМ НАДН путем растворения 4,5 мг НАДН в 1,5 мл 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0. Хранить на льду, защищенном от света.
3. Разморозьте стоковые растворы UDP-глюкозы, АТФ, фосфоенолпирувата и NDP-киназы на льду.
4. Разогрейте водяную баню до 30 °C.
5. Настройте каждый анализ гликогенсинтазы в пробирке объемом 1,5 мл, добавив реагенты на основе реакционной смеси, перечисленные в таблице 2.
   заметка: Для облегчения установки можно получить мастер-смесь, содержащую достаточное количество каждого из перечисленных реагентов для завершения запланированного количества анализов.
6. Готовят реакцию холостого типа, где НАДН в вышеуказанной смеси заменяют водой. Переложите в одноразовую метакрилатную кювету и с ее помощью установите ноль на спектрофотометре на 340 нм.
7. Возьмите одну 770 мкл аликвоты реакционной смеси в пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 2 мкл NDP-киназы и 2 мкл смеси пируваткиназы/лактатдегидрогеназы, осторожно перемешайте и инкубируйте при 30 °C в течение 3 мин для предварительного нагрева реакционной смеси.
8. Добавьте 30 мкл образца, содержащего гликогенсинтазу, в 20 мМ трис-буфер, pH 7,8; перемешайте и перенесите реакционную смесь в одноразовую метакрилатную кювету.
9. Поместите кювету в спектрофотометр и зарегистрируйте поглощение на длине волны 340 нм с заданными интервалами в течение 10–20 мин. Постройте график полученных поглощений в зависимости от времени.
   заметка: Для контроля неферментативного окисления НАДН следует провести реакцию, в которой образец гликогенсинтазы заменяется 20 мМ трис-буфером. В зависимости от чистоты образца могут потребоваться другие реакции контроля.
10. Определите скорость реакции.

Таблица 1: Исходные растворы, необходимые для анализа активности гликогенсинтазы.

компонент	Направления
50 мМ Трис pH 8,0	Растворите 0,61 г основания Tris в ~ 80 мл воды. Охладите до 4 °C. Отрегулируйте pH до 8,0 с помощью HCl и увеличьте объем до 100 мл с водой.
Буфер HEPES 20 мМ	Растворите 0,477 г HEPES в ~ 80 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,0 с помощью NaOH и доведите объем до 100 мл водой.
132 мМ Tris/32 мМ буфер KCl pH 7,8	Растворите 1,94 г основания Tris и 0,239 г KCl в ~90 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью HCl и доведите объем до 100 мл водой.
0,8% по объему устричного гликогена	Взвесьте 80 мг устричного гликогена и добавьте в воду. Доведите окончательный объем до 10 мл с водой и слегка подогрейте/перемешайте до полного растворения гликогена.
100 мМ UDP-глюкоза	Растворите 0,31 г UDP-глюкозы в воде и сделайте конечный объем до 1 мл. Хранить в аликвотах, замороженных при -20 °C. Стабильно в течение нескольких месяцев.
50 мМ АТФ	Растворите 0,414 г АТФ в ~ 13 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,5 с помощью NaOH и доведите объем до 15 мл водой. Хранить в аликвотах в замороженном виде при температуре -20 °C. Стабильно в течение нескольких месяцев.
100 мМ Глюкозо-6-фосфат pH 7,8	Растворите 0,282 г глюкозо-6-фосфата в ~ 7-8 мл воды. Отрегулируйте pH до 7,8 с помощью NaOH. Сделайте объем до 10 мл водой. Хранить в замороженном виде при температуре -20 °C. Стабильно не менее полугода.
40 мМ фосфоенолпирувата	Растворите 4 мг фосфоенолпирувата в 0,5 мл 20 мл буфера HEPES pH 7,0. Хранить при температуре -20 °C. Стабильно не менее 1 недели.
0,5 М MnCl2	Растворите 9,90 г MnCl2 в окончательном объеме 100 мл воды.
Киназа НДП	Восстановите лиофилизированный порошок с достаточным количеством воды, чтобы получить 1 ед/мкл раствора. Подготовьте аликвоты, заморозьте в жидком азоте и храните при температуре -80 °C. Стабильно не менее 1 года.

Таблица 2: Состав реакционной смеси для анализа активности гликогенсинтазы.

шт.

компонент	Объем (мкл)
160 мМ Tris/32 мМ буфер KCl pH 7,8	250
Вода	179
100 мМ глюкозо-6-фосфат, pH 7,8	58
0,8 % по объему устричного гликогена	67
50 мМ АТФ	80
4 мМ НАДН	80
100 мМ UDP-глюкоза	28
40 мМ фосфоенолпируват	20
0,5 М MnCl2	8
Итоговый объем	770

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Амилопектин (без амилозы) из восковой кукурузы	Научный центр Фишера	А0456
Амилоза	Биосинт Карбосинт	YA10257
АТФ, динатриевая соль	МиллипорСигма	А3377
D-глюкоза-1,6-бисфосфат, калийная соль	МиллипорСигма	Г6893
D-глюкозо-6-фосфат, натриевая соль	МиллипорСигма	Г7879
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, класс I, из дрожжей	МиллипорСигма	10127655001
Гликоген, тип II из устриц	МиллипорСигма	Г8751
Гексокиназа	МиллипорСигма	11426362001
Метакрилатные кюветы, 1,5 мл	Научный центр Фишера	Тел.: 14-955-128	Метакрилат необходим, так как некоторые процедуры проводятся при длине волны 340 нм и ниже
β-никотинамид адениндинуклеотидфосфат натриевая соль	МиллипорСигма	Н0505
β-никотинамидадениндинуклеотид, восстановленная динатриевая соль	МиллипорСигма	43420
Нуклеозид 5'-дифосфаткиназа	МиллипорСигма	Н0379
Фосфоенолпируват, соль монокалия	МиллипорСигма	П7127
Фосфоглюкомутаза из мышц кролика	МиллипорСигма	П3397
Фосфорилаза А из мышц кролика	МиллипорСигма	П1261
Ферменты пируваткиназы/молочнокислой дегидрогеназы из мышц кролика	МиллипорСигма	П0294
UDP-глюкоза, динатриевая соль	МиллипорСигма	У4625