Анализ на основе клеточного импеданса для мониторинга клеточных процессов в режиме реального времени

Аннотация

Источник: Labadie, T., et al., Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью клеточного анализа в реальном времени. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем процесс мониторинга клеточных событий в реальном времени, включая пролиферацию адгезивных клеток, с помощью анализа клеточного импеданса. Здесь адгезивные ячейки действуют как изоляторы, ограничивая протекание тока между электродами и увеличивая импеданс.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Во время всех экспериментов всегда держите пластины на неэлектростатических поверхностях, таких как бумажные обертки от упаковки. Следуйте приведенному ниже разделу 1, чтобы определить наиболее подходящую концентрацию клеток для посева в электронной микротитровальной пластине (выполненной в виде E-Plate).

1. Определение подходящего количества клеток для заражения клеток

1. За 24 ч до эксперимента подготовьте клетки MDCK (Madin-Darby Canine Kidney) в колбах размером 75 см² для получения свежерасщепленных клеток (примерно 80% слияния).
2. Промойте ячейки 5 мл 1x PBS и отделите их, добавив 3 мл 0,25% раствора Трипсина-ЭДТА.
3. Добавьте 7 мл свежей среды для культивирования клеток и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток с окрашиванием трипановым синим.
4. Отрегулируйте концентрацию клеток до 400 000 клеток/мл с помощью среды для клеточных культур. Выполнение двукратных последовательных разведений в дополнительных пробирках для получения плотности ячеек 200 000; 100,000; 50,000; 25,000; 12,500; и 6 250 клеток/мл. Отрегулируйте диапазон разведения клеток в соответствии с типом клеток и их поведением при росте.
5. Оставьте E-plate (Table of Materials) в положении RT на несколько минут и добавьте по 100 мкл среды для клеточных культур в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Не прикасайтесь к электродам E-Plate.
6. Разблокируйте опоры и вставьте лицевой конец пластины в карман подставки прибора для измерения импеданса (Таблица материалов). Закройте дверцу инкубатора.
7. Откройте программу.
   1. В разделе "Настройка шаблона эксперимента по умолчанию" выберите выбранную колыбель (колыбели) и дважды щелкните на главной странице, затем введите название эксперимента. Нажмите «Макет» и введите необходимую информацию о пробе для каждой выбранной лунки пластины; затем нажмите «Применить», когда закончите. Нажмите "Расписание" | "Шаги" | "Добавить шаг". Программное обеспечение автоматически добавляет шаг 1 с для измерения фонового импеданса (ДИ).
   2. Нажмите «Начать/Продолжить» на вкладке «Выполнить». Нажмите «График», добавьте все образцы, выбрав подходящие скважины, и убедитесь, что CI находится в диапазоне от -0,1 до 0,1, прежде чем переходить к следующему шагу.
8. Снимите тарелку с подставки.
9. Добавьте по 100 мкл каждой клеточной суспензии с шага 1.4 в двух экземплярах в соответствующие лунки и 100 мкл клеточной среды в лунки, используемые в качестве контроля. Оставьте E-пластину в ламинарном проточном колпаке на 30 минут при температуре RT, чтобы обеспечить равномерное распределение ячеек на дне лунок.
10. Вставьте E-образную пластину в карман подставки. Нажмите "Расписание" | "Добавить шаг" в программе и введите значения для мониторинга ячеек каждые 30 минут в течение 200 повторений. Затем выберите «Начать/Продолжить».
11. Проверьте и построите график данных КЕ, нажав на кнопку "График" в программном обеспечении. Подбирают концентрацию клеток, которые находятся непосредственно перед стационарной фазой через 24 ч после посева на планшет, с целью получения клеток, которые еще находятся в фазе роста при вирусной инфекции. Стационарная фаза достигается, когда CI находится на максимальном уровне.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
E-Plate 16 (6 пластин)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	Электронные пластины доступны в различной упаковке
ПБС 1Х	Технологии жизни (gibco)	14040091
ТПК-трипсин	Уортингтон	LS003740
Прибор для анализа клеток в реальном времени xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Приборы xCELLigence RTCA S16 доступны в различных форматах (16-луночные, 96-луночные, одно- или многопланшетные)
Колба для культуры тканей 75 см2	сокол	430641У
MEM 1X	Технологии жизни (gibco)	31095029