Импедансный клеточный анализ для измерения множественности инфекции вируса гриппа

Аннотация

Источник: Labadie, T., et al., Мониторинг выживаемости вируса гриппа вне хозяина с помощью клеточного анализа в реальном времени. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео мы обсуждаем корреляцию между CIT₅₀ и множественностью вирусных инфекций. Инфицированные вирусом клетки проявляют цитопатические эффекты, вызывая их гибель и отслоение от золотого микроэлектрода, что, в свою очередь, снижает импеданс.

Протокол

1. Корреляция между значениями CIT₅₀ и множественностью инфекций

1. Добавьте 100 мкл стерильной питательной среды 1x MEM в каждую лунку Е-планшета. Вставьте E-пластину в карман подставки прибора при температуре 35°C.
2. Измерьте фон, как описано ниже:
3. Откройте программу.
   1. В разделе "Настройка шаблона эксперимента по умолчанию" выберите выбранную базу(ы) и дважды щелкните на верхней странице, затем введите название эксперимента. Нажмите «Макет» и введите необходимую информацию о пробе для каждой выбранной лунки пластины; затем нажмите «Применить», когда закончите. Нажмите "Расписание" | "Шаги" | "Добавить шаг". Программное обеспечение автоматически добавляет шаг 1 с для измерения фонового импеданса (ДИ).
   2. Нажмите «Начать/Продолжить» на вкладке «Выполнить». Нажмите «График», добавьте все образцы, выбрав подходящие скважины, и убедитесь, что CI находится в диапазоне от -0,1 до 0,1, прежде чем переходить к следующему шагу.
4. Снимите E-образную пластину с подставки.
5. Засейте 3 x 10⁴ свежесщепленных MDCK клеток на каждой лунке электронного микротитровального планшета и выращивайте их в течение 24 часов при 35°C с 5%_CO2 так, чтобы они находились в репликативной фазе во время заражения IAV.
6. Инфицируйте клетки MDCK различными 10-кратными разведениями известного титра 6log₁₀TCID₅₀/мл вируса H1N1, используя обратное пипетирование для воспроизводимости, выполнив следующие действия:
   1. Промойте клетки MDCK 2 раза 100 μл MEM без FCS (среды для распространения вируса). Помните об удалении всех сред после второй промывки, чтобы избежать дальнейшего разбавления инокулята.
   2. Добавьте по 100 мкл вирусной суспензии в каждую лунку с помощью одноканальной пипетки. Чтобы избежать загрязнения, действуйте, начиная слева направо, затем сверху вниз в пластине, накрывая оставшиеся лунки крышкой.
   3. Вставьте пластину в карман подставки прибора при температуре 35°C. Будьте осторожны, чтобы избежать резких движений, которые могут привести к загрязнению.
   4. Начните контролировать импеданс ячейки каждые 15 минут в течение не менее 100 часов, как описано:
      1. Вставьте E-образную пластину в карман подставки. Нажмите "Расписание" | "Добавить шаг" в программе и введите значения для мониторинга ячеек каждые 30 минут в течение 200 повторений. Затем выберите «Начать/Продолжить».
   5. После двух циклов измерений (т.е. 30 минут) поставьте аппарат на паузу, нажав на кнопку «Пауза» во вкладке «Выполнить», и снимите Е-пластину с подставки.
   6. Добавьте 1 г/мл TPCK-трипсин в среду для размножения вируса, чтобы расщепить вирусный гемагглютинин.
   7. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл среды для распространения вируса, содержащей TPCK-трипсин, и вставьте E-пластину в карман подставки.
   8. Нажмите «Начать/Продолжить» на вкладке «Выполнить».
      заметка: Не забывайте создавать негативный контроль, соответствующий фиктивно инфицированным клеткам, путем замены вирусной суспензии на среды для размножения вируса.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
E-Plate 16 (6 пластин)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	Электронные пластины доступны в различной упаковке
MEM 1X	Технологии жизни (gibco)	31095029
ТПК-трипсин	Уортингтон	LS003740
Прибор для анализа клеток в реальном времени xCELLigence S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Приборы xCELLigence RTCA S16 доступны в различных форматах (16-луночные, 96-луночные, одно- или многопланшетные)