1. Подготовка реагентов и исходных материалов
- Получение клеток MDCK и стерильной среды для культивирования клеток
- Культивируйте клетки собачьей почки Мадина-Дарби (MDCK) в модифицированной среде Eagle's Medium (MEM) с добавлением 10% инактивированной при нагревании эмбриональной сыворотки теленка (FCS) и антибиотиков (100 единиц/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина).
- После размораживания пропустите клетки MDCK не менее 2 раз перед их инфекцией, чтобы обеспечить полное выздоровление (но менее 30 пассажей, чтобы избежать любого дрейфа в клеточных фенотипах).
- Засейте колбу (колбы) для культуры тканей размером 75 см2, содержащие 30 мл стерильного 1x MEM с 7,5 x 106 клетками MDCK, и инкубируйте при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% содержаниемCO2.
- Подготовка оборудования для контроля импеданса
- Поместите инструмент в инкубатор при температуре 35 °C и дайте ему прогреться не менее 2 часов.
- Подключите его к блоку управления, размещенному снаружи инкубатора.
- Приступайте к процедурам очистки в соответствии с рекомендациями производителя, прежде чем приступать к оставшейся части эксперимента.
- Производство прикладов IAV на ячеях MDCK
- Для размножения и амплификации вирусов H1N1 высейте 7,5 x 106 клеток MDCK в две колбы для культуры тканей размером 75см2 и инкубируйте в течение 24 часов при 37 °C до 90%–100% конфлюенции.
- Сцеживают клеточную культуральную среду из клеточного монослоя в колбы по75 см 2 колбы. Промойте клетки 5 мл стерильного 1x PBS.
- Удалите PBS и добавьте 5 мл 1x PBS, чтобы снова промыть клетки.
- Пометьте одну колбу как контрольную и удалите PBS перед добавлением 15 мл среды для распространения вируса (1x MEM с 0% FCS) на монослой. Инкубируйте эту колбу в инкубаторе при температуре 35 °C с 5%CO2. Используйте его для сравнения через 3 дня после размножения.
- Разморозьте один флакон IAV stock в режиме РТ. Разбавьте вирус до соответствующей концентрации в пробирке объемом 1,5 мл, содержащей среду для распространения вируса (1x MEM с 0% FCS).
- Удалите 1x PBS из колбы 75 см2 и инфицируйте клетки MDCK при кратности инфекции (MOI) 1 x 10-3 или 1 x 10-4 бляшечных единиц на клетку (pfu/клетка) путем добавления 1 мл разведенного вируса к монослою клетки.
- Адсорбировать вирус к клеткам MDCK в течение 45 мин при ЛТ, регулярно помешивая колбу каждые 15 мин.
- Аккуратно удалите инокулюм и добавьте 15 мл среды для распространения вируса на колбу, содержащую 1 мкг/мл TPCK-трипсина (трипсин/L-1-тозиламид-2-фенилэтилхлорметилкетон), чтобы расщепить вирусный гемагглютинин HA0 на субъединицы HA1 и HA2 (событие, необходимое для слияния HA с эндосомальной мембраной и высвобождения вирусного генома).
- Инкубируйте колбы при 35 °C и 5%CO2 в течение не менее 3 дней, чтобы вирус размножился.
- Наблюдайте за клетками MDCK под микроскопом при 40-кратном увеличении и ищите цитопатические эффекты (CPE) на клетках (сравнивая их с контрольной колбой для клеток). Если CPE не завершен (т.е. около 80% клеток отделены от субстрата), поместите колбы обратно в инкубатор еще на 24 часа.
- Когда CPE будет завершена, сцедите надосадочную жидкость клеточной культуры и центрифугируйте при 300 x g в течение 10 минут для гранулирования клеточного мусора.
- Осветленную надосадочную жидкость перенесите в пробирку объемом 15 мл и аликвотное потомство вирусов в одноразовые стерильные криогенные флаконы. Немедленно поместите криопробирки при температуре -80 °C для замораживания и хранения вирусов.
- Инфицируйте клетки MDCK различными 10-кратными разведениями известного титра 6 log10 TCID50/мл вируса H1N1, используя обратное пипетирование для воспроизводимости, выполнив следующие действия:
- Промойте клетки MDCK 2 раза 100 μл MEM без FCS (среды для распространения вируса). Помните об удалении всех сред после второй промывки, чтобы избежать дальнейшего разбавления инокулята.
- Добавьте по 100 мкл вирусной суспензии в каждую лунку с помощью одноканальной пипетки. Чтобы избежать загрязнения, начните слева направо, затем сверху вниз в пластине, накрыв оставшиеся лунки крышкой.
- Вставьте пластину в карман подставки прибора при температуре 35 °C. Будьте осторожны, чтобы избежать резких движений, которые могут привести к загрязнению.
- Начните контролировать импеданс ячейки каждые 15 минут в течение не менее 100 часов, как описано в шаге 2.10.
- После двух циклов измерений (т.е. 30 минут) поставьте аппарат на паузу, нажав на кнопку «Пауза» во вкладке «Выполнить», и снимите Е-пластину с подставки.
- Добавьте 1 мкг/мл TPCK-трипсина в среду для размножения вируса для расщепления вирусного гемагглютинина.
- Добавьте в каждую лунку по 100 мкл среды для распространения вируса, содержащей TPCK-трипсин, и вставьте E-пластину в карман подставки. 8. Нажмите «Начать/Продолжить» во вкладке «Выполнить».
заметка: Не забывайте создавать негативный контроль, соответствующий фиктивно инфицированным клеткам, путем замены вирусной суспензии на среды для размножения вируса.
2. Кинетика выживания IAV
- Подвергните IAV воздействию дистиллированной воды с солевым раствором при температуре 35 °C и проверьте их инфекционность с течением времени, измерив снижение импеданса клеток.
- Приготовьте дистиллированную воду с солевым раствором, добавив NaCl до конечной концентрации 35 г/л в дистиллированную воду. Добавьте 900 μL солевой воды в 2 мл криопробивки.
- Добавьте 100 μL вирусного материала в солевую воду и поместите криопробирки в инкубатор (35 °C, 5%CO2) на 1 ч, 24 ч или 48 ч.
- Высадите 100 мкл (содержащий 3 x 104) свежесщепленных клеток MDCK на 16-луночный микротитровальный планшет и выращивайте в течение 24 ч при 37 °C и 5%CO2.
- Заражайте клетки 100 мкл подвергшихся воздействию вирусов (предварительно разбавленных в 10 раз в питательных средах) методом обратного пипетирования для воспроизводимости путем повторения раздела 1.4.
- Контролируйте импеданс ячейки каждые 15 минут в течение не менее 100 часов.
