Анализ реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты для оценки окислительного стресса в сыворотке крови человека

Аннотация

Источник: Borges, C. R. et al., Оценка окислительного стресса в биологических образцах с использованием анализа реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты. J. vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует анализ реактивных веществ тиобарбитуровой кислоты (TBARS) для оценки окислительного стресса в биологических образцах.

Протокол

Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом

1. Анализ TBARS

ПРИМЕЧАНИЕ: Как только анализ TBARS начался, он должен быть завершен без остановки.

1. Возьмите столько проб и стандартов, центрифугированных при 1500 x g в течение 10 мин при 4 °C. После центрифугирования храните стеклянные пробирки, содержащие образцы и стандарты, в стеклянных пробирках RT. по мере необходимости для количества анализируемых образцов и маркируйте их названиями образцов. Затем добавьте по 100 мкл каждого подготовленного образца (лизаты клеток HepG2, липопротеиды низкой плотности, сыворотка человека) в каждую стеклянную пробирку.
2. Добавьте 200 мкл 8,1% SDS в каждый образец и стандарт и осторожно поворачивайте стеклянную трубку круговыми движениями, чтобы перемешать образец.
3. Добавьте 1,5 мл буфера из ацетата натрия 3,5 М (pH = 4) к каждому образцу и стандарту.
4. Добавьте 1,5 мл буфера из ацетата натрия 3,5 М (pH = 4) к каждому образцу и стандарту.
5. Доведите окончательный объем до 4 мл для каждого образца и стандарта, добавив 700 мкл деионизированной воды.
6. Плотно закройте каждую стеклянную пробирку крышкой и выдерживайте в нагревательном блоке, установленном при температуре 95 °C, в течение 1 ч. Накройте стеклянные пробирки алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить образование конденсата в верхней части пробирок.
7. Снимите стеклянные трубки с нагревательного блока и выдержите на льду в течение 30 минут.
8. Центрифугируйте образцы и стандарты при 1500 x g в течение 10 мин при 4 °C. После центрифугирования стеклянные пробирки с образцами и стандартами храните в RT.
   заметка: Хранение образцов на льду или при температуре 4 °C приведет к выпадению в осадок всего образца или стандарта.
9. Сразу после центрифугирования аликвот 150 мкл надосадочной жидкости из каждой пробирки и поместить в отдельную лунку 96-луночного планшета.
10. Удалите пузырьки из каждой лунки с помощью наконечника для дозатора.
    заметка: Наличие пузырьков приводит к несогласованным показателям абсорбции, что приводит к высокой погрешности анализа.
11. Считывание поглощений на длине волны 532 нм. Вычтите среднее значение поглощения пустых образцов из всех других показаний поглощения.
12. Создайте стандартную кривую, построив график пустых и вычтенных показаний поглощения на длине волны 532 нм в зависимости от известной концентрации каждого стандарта. Подгонка точек данных с помощью линейной регрессии. Рассчитайте концентрации неизвестных образцов с помощью уравнения линии линейной регрессии, полученной из стандартной кривой.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1x Стерильный PBS pH 7.4 1 л	VWR, PA	101642--262	Реагент для лизиса клеток
Автономная центрифужная пробирка объемом 50 мл	Корнинг, штат Нью-Йорк	CLS430897	Общий материал
Планшет на 96 лунок, Необработанный, прозрачный, с крышкой, Нестерильный	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Для измерения абсорбции
Amicon Ultra-0.5 Центробежный спиновой фильтр 100 кД	Научный центр Фишера, Нью-Гэмпшир	UFC510024	Очистка ЛПНП
Колпачки для стеклянных пробирок	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15Д	Для анализа TBARS
Хлорид меди II	СИГМА, МО	222011-250Г	Для индуцирования окисления
Пробирки для культивирования, одноразовые, с завинчивающейся крышкой, боросиликатное стекло (13 x 100 мм)	VWR, PA	53283-800	Для анализа TBARS
Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, Вирджиния	НВ-8065	Клеточные среды HepG2
Пробирки Eppendorf Safe-Lock, 1,5 мл	эппендорф, штат Нью-Йорк	22363204	Общий материал
Пробирки Eppendorf Safe-Lock, 2,0 мл	Genesee Sceitific, Калифорния	22363352	Общий материал
Фетальная бычья сыворотка США	Омега Научный, Калифорния	ФБ-11	Для культивирования клеток
Ледяная уксусная кислота	СИГМА, МО	27225-1Л-Р	Реагент TBARS
Коктейль ингибиторов протеазы Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	Реагент для лизиса клеток
ХЕПЕС	СИГМА, МО	Н3375-250Г	Растворитель ЛПНП
Соляная кислота (HCl)	Научный центр Фишера, Нью-Гэмпшир	А144-212	Реагент для лизиса клеток
Центрифуга Legend Micro 17	Thermo Scientific, MA	75002431	Общий материал
Липопротеины низкой плотности, Плазма крови человека	Афины Исследования и Технологии, Джорджия	12-16-120412 (Английский	Прототип биологической матрицы
Магнитные мешалки, восьмиугольник 6-ассортиментный	VWR, PA	58948-025	Общий материал
Малоновый диальдегид бис (диметилацеталь)	СИГМА, МО	8207560250	TBARS Стандарт
Микропланшетный спектрофотометр Multiskan Go	Научный центр Фишера, Нью-Гэмпшир	51119200	Для измерения абсорбции
НП-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100МЛ	Реагент для лизиса клеток
Хлорид натрия	СИГМА, МО	С7653-1КГ	Реагент для лизиса клеток
Додецилсульфат натрия (SDS)	СИГМА, МО	436143-100Г	Реагент TBARS
Гидроксид натрия	СИГМА, МО	367176-2,5КГ	Реагент TBARS
Концентратор SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Для концентрирования клеточных лизатов
Тиобарбитуровая кислота	СИГМА, МО	Т5500-100Г	Реагент TBARS
База ТРИС	Флюка, Джорджия	93362	Реагент для лизиса клеток

)