$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка
- Добавьте 5 мл пенициллина/стрептомицина (10000 ЕД/мл) и 5 мл и 10 мл коммерчески доступных добавок к 500 мл полной классической среды с сывороткой. Аликвота 50 мл среды изначально.<бр />
заметка: Не возвращайте среду обратно на склад во избежание загрязнения.
- Выложите аликвоту полного классического средства на лед.
- Используйте 70% этанол для очистки препарирующего микроскопа, щипцов и ножниц.
- Приготовьте две чашки для клеточных культур (10 см), одну на препарирующем микроскопе, а другую на льду; положите в каждую чашку по 10 мл полной классической среды.
2. Этапы эксперимента (Рисунок 1)
- Мышам C57BL/6J вводили мышей примерно после рождения (P) 20 с использованием 75-100 мг/кг кетамина и 7,5-10 мг/кг ксилазина, вводимого внутрибрюшинно. Перед вскрытием держите глаза в полной классической среде на льду.
- Удалите соединительную ткань (мышечную и жировую ткань) и зрительный нерв на глазу.
- С помощью микроножниц сделайте надрез по окружности на 0,5 мм позади лимба роговицы. Удалите комплекс роговицы/радужной оболочки, стекловидное тело и хрусталик.
- Сделайте разрез диаметром 1 мм перпендикулярно краю разреза по направлению к зрительному нерву и разрежьте окружную полосу шириной 1 мм. Разделяют центральную и периферическую области комплекса. Используйте щипцы для отшелушивания сетчатки от комплекса РПЭ/сосудистая оболочка/склера.
- Держите периферическую сосудистую оболочку в полной классической среде на льду; изолируйте другой глаз и повторите процесс, чтобы разрезать вторую полосу.
- Разрежьте круглую ленту на 6 ~равных квадратных частей (~1 мм x 1 мм).
заметка: Никогда не прикасайтесь к краям.
- Разморозьте экстракт базальной мембраны (BME) в соответствии с инструкцией производителя. Добавьте 30 мкл/лунку BME в центр каждой лунки 24-луночного тканевого планшета. Убедитесь, что капля BME образует выпуклый купол в нижней части пластины, не касаясь краев.
заметка: Разморозьте BME на ночь в холодильнике. BME должен находиться на льду в любое время после оттаивания.
- Поместите салфетку в середину BME.
заметка: Не расплющивайте сосудистую оболочку; как правило, позвольте ткани расширяться внутри БМЭ. Ориентация ткани (склеральной стороной вверх или вниз) не влияет на результат эксперимента.
- Инкубируйте пластину при температуре 37 °C в течение 10 минут, чтобы гель застыл.
- Добавьте 500 мкл полной классической среды/лунки.
- Меняйте классическую среду через день (500 μл). Прорастание сосудистой оболочки кожи можно наблюдать через 3 дня под микроскопом.
заметка: Для лечения фактором роста следует заморить ткани голодом в течение 4 ч. Разведите исследуемое соединение в среде с пониженным фактором роста (повышение 1:200 вместо 1:50).
3. Компьютеризированный метод количественной оценки SWIFT-Choroid (Рисунок 2)
ПРИМЕЧАНИЕ: Был использован компьютеризированный метод измерения площади, занятой растущими сосудами. Перед количественной оценкой необходим плагин макроса для программного обеспечения ImageJ.
- Откройте изображение прорастания сосудистой оболочки с помощью ImageJ и отметьте галочкой "Image |Тип| 8-битный» с оттенками серого.
- Перейдите в раздел "Изображение | Настройка | Яркость/Контрастность (Ctrl/shift/C)" и оптимизируйте контрастность.
- Используйте функцию волшебной палочки, чтобы обвести и удалить с изображения ткань сосудистой оболочки, которая присутствует в центре ростков (с помощью сочетания клавиш "F1") (Рисунок 2A, B).
заметка: Установите допустимость волшебной палочки на 20-30%.
- Удалите фон изображения с помощью бесплатных инструментов выделения (Рисунок 2C). Перейдите в раздел "Изображение | Настройка | Порог (Ctrl/shift/T)". Используйте пороговую функцию для определения микрососудистых ростков на фоне и периферии (Рисунок 2D).
- Нажмите «F2», и появится сводка. Сохраните изображение выбранной области, нажав кнопку "Сохранить". Сохраните его в той же папке, что и исходное изображение, для дальнейшего использования.
- После того, как группа образцов будет измерена, скопируйте записанную для анализа данных.
заметка: Также можно измерить площадь (мкм²) с помощью команды "Analyze | Установите масштаб» с помощью изображений с масштабными линейками.
