1. Анализ трансфекции рецептора эстрогена человека β
ПРИМЕЧАНИЕ: Асептическая техника и ламинарный колпак требуются для 1-го дня протокола анализа.
- Приготовьте разведения 17β-эстрадиола по стандартной кривой.
- Перенесите среду для восстановления клеток и среду для скрининга соединений (CSM) из морозильной камеры и разморозьте их на водяной бане при температуре 37 °C.
- Маркировка микроцентрифужных пробирок промежуточных 1 и 2 (INT1, INT2) и 1-8.
- Заполните INT1 995 μл CSM, INT2 615 μл CSM, пробирку 1 900 μл CSM, а пробирки 2-8 600 μл CSM. Отложите трубку 8 в сторону.
- Перенесите 5 мкл 100 μM 17β-эстрадиола в INT1. Выбросьте кончик. Вихрь.
- Перед каждым переносом промывайте пипетку 3 раза, а затем переливайте 10 мкл из INT1 в INT2. Выбросьте кончик.
- Промойте пипетку 3 раза, а затем перелейте 100 мкл из INT2 в пробирку 1. Выбросьте кончик. Переложите 300 μл из пробирки 1 в пробирку 2. Повторите для трубок с 3 по 7. Выбросьте 300 μл из пробирки 7 в контейнер для отходов. Трубка 8 является нулем и не получает эстрадиол. Конечные концентрации гальванических эталонов составляют: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 и 0 пМ эстрадиола.
- Подготовьте образцы составов.
- Вихревые образцы.
- Возьмите 4 мкл каждого образца растения в ДМСО и добавьте к 496 мкл CSM, чтобы получить 0,8% раствор ДМСО.
- Быстрое размораживание репортерных ячеек.
- Достаньте пробирку со средой для восстановления клеток из водяной бани при температуре 37 °C. Продезинфицируйте наружную поверхность с помощью 70% этанола.
- Извлеките репортерные ячейки из хранилища при температуре -80 °C и размораживайте, перенеся 10 мл предварительно нагретого CRM в пробирку замороженных клеток.
- Закройте пробирку с репортерными ячейками и перенесите их на водяную баню при температуре 37°C на 5-10 минут.
- Достаньте тюбик с суспензией репортерных клеток из водяной бани. Несколько раз аккуратно переверните трубку клеток, чтобы разбить агрегаты клеток и получить однородную суспензию. Очистите поверхность пробирки 70% этанолом.
- Пробирное покрытие.
- Нанесите 100 мкл суспензии репортерных клеток в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
- Диспонируйте 100 мкл проб в трех экземплярах в соответствующие пробирные лунки.
- Перенесите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, увлажненным 5%CO2 на 22-24 часа.
- Подложка для обнаружения размораживания и буфер для обнаружения в темном холодильнике на ночь, чтобы подготовиться к дню 2.
- Непосредственно перед окончанием инкубации планшетов извлеките субстрат и буфер обнаружения из холодильника и поместите в место с низким уровнем освещенности, пока они не уравновесятся до состояния RT. Оказавшись на RT, осторожно переверните каждую трубку несколько раз, чтобы тщательно перемешать растворы.
- Непосредственно перед завершением инкубации вылейте все содержимое буфера обнаружения в пробирку с субстратом для обнаружения для создания реагента для обнаружения люциферазы. Аккуратно перемешивайте, чтобы не образовалась пена.
- После завершения инкубации переверните тарелку, чтобы выбросить содержимое в соответствующий контейнер для отходов. Аккуратно постучите пластиной по чистому впитывающему бумажному полотенцу, чтобы удалить последние капли из лунок.
- Добавьте по 100 мкл реагента для обнаружения люциферазы в каждую лунку. Оставьте пластину для анализа на RT в течение 15 минут. Не встряхивайте тарелку.
- Количественное определение люминесценции с помощью 96-луночного люминометра.
