Резонансный перенос энергии Форстера с временным разрешением для мониторинга фосфорилирования белков в клетках

Аннотация

Источник: Padros, J. et al., Резонансные анализы переноса энергии Фёрстера с временным разрешением для измерения эндогенных фосфорилированных белков STAT в клетках человека. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео описывает резонансный перенос энергии Фёрстера с временным разрешением или анализ TR-FRET для определения фосфорилирования эндогенного белка с помощью донорских и акцепторных флуорофоров, помеченных на антителах, специфичных к тестируемому белку. Этот метод предназначен для измерения фосфорилирования тестовых белков в клеточных лизатах.

Протокол

1. Клеточная культура

1. Поддерживайте клетки в увлажненном инкубаторе с температурой 37 °C/5% CO₂ и культивируйте либо DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (клетки HeLa и A431), либо RPMI с добавлением 15% FBS (клетки U266B1). Культивируйте клетки до тех пор, пока они не достигнут 70-80% конфлюенции, затем трипсинизируйте их и пассируйте или используйте для анализов.
   заметка: Питательные среды содержали фенол красный. Перед проведением анализов не проводилось сывороточное голодание для какой-либо клеточной линии.

2. Титрование стимулятора или ингибитора с использованием протокола двухпланшетного анализа с адгезивными клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура описывает, как определить потенции стимулятора или ингибитора путем создания кривой концентрация-реакция на основе серии разведения испытуемого соединения.

1. Посев клеток
   1. Диспонируйте 50 мкл клеток с предварительно оптимизированной плотностью (40 000 клеток HeLa/лунка для STAT3 и STAT6; 75 000 клеток A431/лунка для STAT5) в 96-луночный планшет, обработанный культурой тканей, в соответствующей питательной среде. Инкубировать в течение ночи при 37 °C/5% CO₂,
      заметка: Необходимо определить оптимальную плотность клеток и время инкубации культур.
2. Разведения исследуемых соединений
   1. Приготовьте промежуточную серию 2-кратного разведения испытуемого соединения (соединений) путем последовательного разбавления соединения(ов) (разведения с интервалом в поллогарифма) в 12 лунках полипропиленового 96-луночного планшета в среду, не содержащую сыворотки.
      заметка: Для точной оценки EC₅₀ или IC₅₀ рекомендуется проводить кривую концентрация-реакция с 12-точечным интервалом в поллогарифма, по крайней мере, в двух экземплярах.
   2. В качестве альтернативы, для гидрофобных, растворимых в диметилсульфоксиде (ДМСО) тестовых соединений, проводят начальное разведение в 100% ДМСО, а затем разбавляют серию разбавлений соединения в среду><, не содержащую сыворотки. заметка: Допуск к ДМСО должен быть установлен перед проведением испытательного титрования соединения в транспортном средстве ДМСО. Важно поддерживать одинаковые концентрации растворителей между обработанными и необработанными клетками. Кроме того, при испытании серийных разведений соединений концентрации растворителя всегда должны оставаться постоянными по всей серии разведения.
3. Клеточная терапия
   1. Для стимуляции клеток добавьте 50 μL бессывороточной среды отдельно (необработанные клетки) или содержащей стимулятор (2x).
   2. Инкубируйте в течение предварительно оптимизированного времени при комнатной температуре (RT) или 37 °C (интерферон (ИФН) α2b/20 мин при RT для STAT3; эпидермальный фактор роста (EGF)/10 мин при RT для STAT5; интерлейкин (IL) -4/20 мин при RT для STAT6). Затем перейдите к разделу 2.4.
      заметка: Необходимо определить оптимальную температуру инкубации.
   3. Для ингибирования клеток добавьте 25 мкл только бессывороточной среды (необработанные клетки) или содержащей ингибитор (4x).
   4. Инкубируйте в течение предварительно оптимизированного времени при RT или 37 °C (ингибитор JAK 1/30 мин при RT для STAT3 и STAT6; Эрлотиниб/15 мин в ЛТ для STAT5).
   5. Добавьте 25 мкл бессывороточной среды отдельно (необработанные клетки) или содержащей стимулятор (4x) при EC₈₀.
   6. Инкубируйте в течение предварительно оптимизированного времени при RT или 37 °C (те же условия, что и для шага 2.3.2).
4. Лизис клеток
   1. Подготовьте специальный 1x Supplemented Lysis Buffer для набора в соответствии с указаниями производителя.
      заметка: В обязательном порядке необходимо дополнить 1x Lysis Buffer коктейлем 100x Phosphatase Inguibitor Cocktail, разведенным до конечной концентрации 1x. 1x Дополненный буфер для лизиса содержит 1 мМ фторида натрия, 2 мМ ортованадата натрия и 2 мМ бета-глицерофосфата. Другие ингибиторы фосфатазы не требуются, и их следует избегать. Лизисные буферы и ингибиторы фосфатазы, отличные от тех, которые включены в набор, не рекомендуются, поскольку они могут содержать ингредиенты, которые могут помешать измерению.
   2. Осторожно извлеките и выбросьте питательную среду для клеточных культур, аспирировав надосадочную жидкость.
   3. Немедленно добавьте 50 мкл 1x дополненного буфера для лизиса.
      заметка: Объем буфера для лизиса (25-50 мкл) может быть оптимизирован.
   4. Инкубировать в течение 30 мин при RT при встряхивании (орбитальный планшетный шейкер установлен на 400 об/мин; умеренное перемешивание).
      заметка: Время инкубации лизиса (30-60 мин) может быть оптимизировано. Лизаты можно использовать сразу для обнаружения целевого белка или замораживать при -80 °C.
5. Обнаружение TR-FRET
   1. Приготовьте смесь для обнаружения антител 4x в буфере для обнаружения 1x в соответствии с указаниями производителя.
   2. На этом этапе переноса осторожно пипетируют 15 мкл клеточного лизата из 96-луночного культурального планшета в лунку белого микропланшета малого объема на 384 лунки.
   3. Добавьте 15 мкл положительного контрольного лизата и 15 мкл 1x буфера для лизиса (отрицательный контроль) для разделения пробирных лунок.
   4. Добавьте 5 мкл 4x смеси для обнаружения антител (либо Eu-Ab1/FR-Ab2 для обнаружения фосфобелка, либо Eu-Ab3/FR-Ab4 для обнаружения общего белка) в каждую из лунок для анализа.
   5. Накройте планшет герметиком для планшетов и выдерживайте от 1 ч до ночи в режиме RT, в зависимости от анализа (см. соответствующий технический паспорт).
      заметка: Необходимо оптимизировать оптимальное время считывания для каждого анализа и клеточной линии. Пластину можно считывать несколько раз без негативного влияния на эффективность анализа.
   6. Снимите герметик для клейких пластин и прочитайте пластину на совместимом с TR-FRET считывателе микропланшетов.
      заметка: Рекомендуется использовать флуориметры на основе фильтров, хотя можно использовать некоторые монохроматоры. Убедитесь, что установлен соответствующий оптический модуль (фильтры и зеркало) для TR-FRET. Используйте длину волны возбуждения 320 или 340 нм для возбуждения хелата европия. Считывание анализов на длине волны 615 нм (или 620 нм) и 665 нм для обнаружения излучения донора европия и акцепторного флуорофора соответственно. Настройки прибора будут зависеть от конкретного считывателя. Представленные здесь данные получены с использованием возбуждения на основе лампы, задержки 90 мкс, времени интегрирования 300 мс и 100 вспышек на лунку. Анализ фосфо-STAT4, однако, был просчитан с использованием лазерного возбуждения для генерации более высоких отношений сигнал/фон (S/B).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
96-луночный микропланшет, прозрачный, плоское дно, полистирол, обработанный культурой тканей, стерильный	Корнинг	No 3595	Это планшет для культивирования клеток при использовании протокола двухпланшетного анализа. Можно использовать другие 96-луночные планшеты для клеточных культур
384-луночный микропланшет, белый, малый объем	ПеркинЭлмер	6007290	Это планшет для определения TR-FRET при использовании протоколов двух- или однопланшетного анализа. Можно использовать другие небольшие объемные белые 384-луночные планшеты
Клеточная линия A431	АТКС	ЦРЛ-1555
Адгезивный микропластинчатый пломб	ПеркинЭлмер	6050185
Модифицированная среда Eagle от Dulbecco (DMEM)	зубр	319-005-CL	THUNDER TR-FRET совместим с питательной средой, содержащей феноловый красный
Считыватель пластин EnVision Xcite Multilabel	ПеркинЭлмер	2104-0020А	Анализ может быть выполнен на различных планшетных считывателях, оснащенных опцией TR-FRET
Клеточная линия HeLa	АТКС	ВКЛ-2
Мемориальный институт Розуэлл Парк 1640 средний (RPMI)	зубр	350-007-КЛ	THUNDER TR-FRET совместим с питательной средой, содержащей феноловый красный
Трипсин/ЭДТА 0,05%	зубр	325-542-CL
Сверхчистая вода	NA	NA	Используйте воду класса Milli-Q (18 МОм.см) для разбавления буфера для лизиса и буфера для обнаружения