Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были проверены местным институциональным наблюдательным советом
1. Выделение и культивирование нейронных клеток-предшественников человека (hNPCs)
- Поместите мозговую ткань в чашку Петри диаметром 100 мм и осторожно удалите мозговые оболочки с помощью щипцов.
- Перенесите мозговую ткань в коническую трубку объемом 50 мл и дважды промойте ее 20 мл PBS, аккуратно перевернув трубку.
- Инкубируйте мозговую ткань в новой конической трубке объемом 50 мл, погрузив ткань в раствор для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) и ДНКазу I (10 ЕД/мл) на 10 мин при 37 °C.
- Добавьте 5 мл питательной среды для нейронных клеток (см. Таблицу материалов) в трубку, содержащую ткани мозга, и механически диссоциируйте нейросферы, растирая от 20 до 30 раз через наконечник пипетки объемом 1000 мкл для получения суспензии одиночных клеток.
- Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм, чтобы удалить клеточные кластеры.
- Посев суспензии одиночных клеток в вентилируемую колбу Т-25 с 5-10 мл питательной среды для культуры нейрональных клеток с добавлением компонентов, описанных в таблице 1.
- Стерилизуйте раствор гепарина путем фильтрации через фильтр 0,2 мкм. Добавка B-27 без витамина А представляет собой бессывороточную добавку для культивирования нейральных предшественников и стволовых клеток без стимуляции дифференцировки.
заметка: Человеческие нервные клетки-предшественники (hNPC) выделяются из мозга плода человека, собранного из абортированного плода. После 7–10 дней в культуре нейральные стволовые клетки (НСК) образуют свободно плавающие колонии нейросферы, в то время как другие типы клеток остаются во взвешенном состоянии в виде одиночных клеток или прикрепляются к дну колбы. Выделенные hNPC могут культивироваться в виде нейросфер в суспензии в течение нескольких месяцев.
2. Прохождение hNPC
- Соберите среды, содержащие плавающие сферы, большие и малые нейросферы, и перенесите их в коническую пробирку объемом 50 мл.
заметка: По неизвестным причинам сроки расщепления нейросфер варьируются от 7 до 30 дней. Однако, как правило, нейросферы необходимо пропускать, когда они достигают диаметра более 700-900 мкм. В это время центр нейросферы начинает темнеть, что считается признаком высокой скорости гибели клеток.
- Раскрутите нейросферы центрифугированием при 300-400 x g в течение 3 минут.
- Осторожно отаскайте надосадочную жидкость, а затем погрузите сферы в 500 мкл размороженного реагента для диссоциации клеток (см. Таблицу материалов).
- Изготовьте аликвоты реагента для диссоциации клеток, добавив 500 мкл на 1,5 мл микропробирок и храните при -20 °С. Чтобы избежать потери активности фермента, разморозьте реагент для диссоциации клеток, подержав его при температуре RT, или нагрейте в течение 5 минут в ванне с водой/шариками при температуре 37 °C.
- В зависимости от плотности и размера сфер инкубируйте погруженные сферы при температуре 37 °C в течение 5-15 минут.
- Добавьте 5-10 мл предварительно подогретой питательной среды в нейросферы, содержащие коническую пробирку объемом 50 мл, и центрифугируйте при 300-400 x g в течение 5 мин для осаждения нейросфер.
- Аспирируйте надосадочную жидкость и осторожно пипетируйте вверх и вниз с помощью пипетки объемом 1000 мкл в 2 мл питательных сред до тех пор, пока все нейросферы не окажутся в одноклеточной суспензии><.
заметка: Диссоциация станет заметна невооруженным глазом. До диссоциации нейросферы имеют форму сфер. После погружения в диссоциационный реагент и пипетирования вверх и вниз они станут одиночными клетками.
- Подсчитайте и поместите отдельные клетки, от 2 до 3 миллионов клеток в колбу Т-25, в 10 мл питательных сред.
- Подкармливайте клетки каждые 3 дня, заменяя половину питательных сред.
- Оседайте нейросферы, наклонив колбу так, чтобы она находилась на ее нижнем углу. Подержите колбу в таком положении около 1-2 минут, пока нейросферы не осядутся. Затем осторожно аспирируйте половину среды, введя серологическую пипетку в среду над осевшими нейросферами. Диссоциированные клетки могут агрегировать в сферы через 2-3 дня в культуре.
3. Замораживание hNPC
- Приготовьте среду для замораживания клеток, добавив ДМСО в питательную среду до конечной концентрации 10% (v/v) или используйте коммерчески доступную среду для криоконсервации для чувствительных типов клеток (см. Таблицу материалов).
- Отсортируйте большие сферы, переложив среду в коническую трубку объемом 50 мл и дав сферам осесть под действием силы тяжести. Затем извлеките и перенесите большие нейросферы в новую коническую трубку объемом 50 мл для пропускания с помощью наконечника для пипетки объемом 200 или 1000 мкл.
заметка: Нейросферы с диаметром более 900 мкм считаются большими, а с диаметром менее 500 мкм — малыми.
- Раскрутите оставшиеся нейросферы центрифугированием при 300-400 x g в течение 3 мин. Осторожно удалите надосадочную жидкость.
- Суспендируйте до 100 сфер в 1 мл реагента для криоконсервации и перенесите его в криопробирку.
- Хранить в течение ночи при температуре -80 °C в контейнере для заморозки клеток (см. Таблицу материалов) и на следующий день переместить его в жидкий азот для длительного хранения><.
заметка: Предпочтительно замораживать нейросферы малого и среднего размера (менее 900 мкм в диаметре) и избегать замораживания больших нейросфер (более 900 мкм в диаметре) или отдельных клеток. Чтобы уменьшить повреждение клеток во время размораживания образца, поддерживайте плотность клеток, засеивая размороженные нейросферы в небольшую колбу Т25.
4. Оценка нейротоксичности
ПРИМЕЧАНИЕ: Цитотоксичность исследуемых соединений оценивается в 384-луночных планшетах (см. Таблицу материалов) с использованием анализа жизнеспособности люминесцентных клеток (см. Таблицу материалов). hNPC получают по тому же методу, за исключением незначительных модификаций, описанных в разделе «Дифференциация и лечение hNPC». Затем с помощью считывателя микропланшетов измеряют люминесцентный сигнал, генерируемый в результате анализа жизнеспособности люминесцентных клеток. Люминесцентный сигнал пропорционален концентрации АТФ в клетках, которая, в свою очередь, прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток, присутствующих в каждой лунке.
- покрытие
- Добавьте 30 мкл поли-L-лизина (ФАПЧ) на лунку 384-луночного планшета.
- Инкубировать в течение 1 ч при РТ.
- Постирайте 2 раза с PBS.
- Дайте ему высохнуть при RT (около 30 минут).
- Добавьте 30 мкл ламинина (50 мкг/мл) на лунку 384-луночного планшета.
- Выдерживать в течение 2 ч при температуре 37 °C.
- Постирать 2x с PBS.
заметка: 384-луночные планшеты с покрытием можно хранить при температуре 4 °C в течение 1 месяца.
- Покрытие ячеек
- Подсчитайте и затарьте 20 000 одноклеточных нейросфер в лунку 384-луночного планшета в 25 мкл дифференцировочной среды.
- Выдерживать 5 дней при температуре 37 °C.
- Через 5 дней обрабатывайте клетки в течение 24 ч испытуемыми соединениями, приготовленными в 6 раз выше конечной желаемой концентрации в объеме 5 мкл (чтобы конечный объем составил 30 мкл на лунку).
- Анализ жизнеспособности клеток
- Добавьте 30 μл реагента для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток на лунку 384-луночного планшета.
заметка: Добавьте объем реагента для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток, равный объему, присутствующему в каждой лунке. Разморозьте реагент для анализа жизнеспособности люминесцентных клеток и уравновесьте его до RT перед использованием.
- Встряхните на шейкере в течение 2 минут (чтобы перемешать и вызвать лизис клеток).
- Отжим смесь центрифугированием при 300-400 х г в течение 30 с.
- Инкубируйте 384-луночный планшет в течение 10 минут при РТ в защищенном от света месте (для стабилизации люминесцентного сигнала).
- Запись люминесценции с помощью считывателя микропланшетов.
заметка: Для анализа жизнеспособности используйте соответствующие контрольные препараты, включая Velcade (в конечной концентрации 10 мкМ) в качестве положительного и HBSS, содержащий ДМСО (с конечной концентрацией 0,1% или 0,2%) в качестве отрицательного контроля.
Таблица 1. Компоненты, необходимые для изготовления 100 мл питательных сред
| количество | компонент |
| 100 мкл | EGF (20 нг/мл) |
| 100 мкл | FGF (10 нг/мл) |
| 2 мл | В-27, минус витамин А (50X) |
| 1 мл | L-аланил-L-глутамин (100X) (см. таблицу материалов) |
| 4 мкл | Гепарин (2 мкг/мл) |
| 96,8 мл | Среда для культивирования нейрональных клеток (см. таблицу материалов) |
