Анализ комплементации расщепленной люциферазы для выявления специфических белок-белковых взаимодействий

Abstract

Источник: Wiertelak, W. et.al., Демонстрация гетерологичных комплексов, образованных мембранными белками типа III типа по Гольджи, с использованием анализа комплементации расщепленной люциферазы. J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует анализ комплементации расщепленной люциферазы для обнаружения белок-белковых взаимодействий. В этом анализе представляющие интерес белки помечаются малыми и большими фрагментами фермента люциферазы. Когда белки взаимодействуют, большие и малые фрагменты объединяются, образуя активный ферментный комплекс, который в присутствии определенного субстрата выделяет яркую люминесценцию, которую можно измерить.

Protocol

1. Транзиторная трансфекция экспрессионных плазмид в клетки

1. Соберите адгезивное HEK293T клеточной культуре путем трипсинизации и ресуспендируйте клетки в специальной полной питательной среде. Поместите ячейки (2 x 10⁴/100 μл/лунка) на 96-луночный планшет с белой стороной. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех протестированных комбинаций и элементов управления, включая реплики.
   заметка: Старайтесь использовать только внутренние 60 лунок пластины, чтобы свести к минимуму тепловые сдвиги и избежать ночного испарения. Настоятельно рекомендуется использовать пластины с покрытием из поли-D-лизина, такие к....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% раствор трипсин-ЭДТА			Культура клеток
Адгезивная клеточная линия млекопитающих			Культура клеток
BioCoat Poly-D-Lysine 96-луночный белый/прозрачный микропланшет с плоским дном, обработанный TC, с крышкой	Корнинг	356651	Пластиковая посуда
Центрифуга для клеточных культур			Пластиковая посуда
Добавки для клеточных культур (термоинактивированная фетальная бычья сыворотка, L-глютамин, пенициллин, стрептомицин)			Культура клеток
CO2-инкубатор			устройство
Экспрессирующие плазмиды, кодирующие представляющий интерес белок(ы), не помеченные фрагментами NanoBiT			проба
Реагент для трансфекции FuGENE HD	Компания Promega	Е2311	проба
GloMax Discover Microplate Reader (или другой люминесцентный считыватель микропланшетов)	Компания Promega	ГМ3000	устройство
Питательная среда, предназначенная для используемой клеточной линии			Культура клеток
Материалы и реагенты для стандартного молекулярного клонирования (бактерии, термостабильная полимераза, ферменты рестрикции, ДНК-лигаза, материалы и реагенты для очистки нуклеиновых кислот)			проба
Стартовая система NanoBiT MCS	Компания Promega	Н2014	Этот набор содержит векторы, позволяющие маркировать интересующие белки фрагментами NanoBiT в различных ориентациях, а также контрольную плазмиду, кодирующую белок HaloTag, слитый с SmBiT, и положительную контрольную плазмидную пару.
Система анализа живых клеток Nano-Glo	Компания Promega	Н2011	Этот набор содержит фуримазин, который представляет собой субстрат, позволяющий обнаруживать активность NanoLuc в живых клетках, и специальный буфер для разведения.
Opti-MEM I Уменьшенная сыворотка Medium, без фенола красного	Gibco	11058021	Культура клеток
Орбитальный шейкер			устройство