$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Транзиторная трансфекция экспрессионных плазмид в клетки
- Соберите адгезивное HEK293T клеточной культуре путем трипсинизации и ресуспендируйте клетки в специальной полной питательной среде. Поместите ячейки (2 x 104/100 μл/лунка) на 96-луночный планшет с белой стороной. Отрегулируйте общее количество скважин для размещения всех протестированных комбинаций и элементов управления, включая реплики.
заметка: Старайтесь использовать только внутренние 60 лунок пластины, чтобы свести к минимуму тепловые сдвиги и избежать ночного испарения. Настоятельно рекомендуется использовать пластины с покрытием из поли-D-лизина, такие как указанные в Таблице материалов, в противном случае ячейки могут отсоединиться во время последующих этапов промывки.
- Культивируйте клетки в течение ночи в стандартных условиях (37 °C, 5%CO2).
- На следующий день трансфектируют клетки с нужными комбинациями экспрессии плазмид.
- Разбавьте экспрессию плазмид в бессывороточной среде (см. Таблицу материалов) до 6,25 нг/мкл для каждой конструкции.
- Добавьте реагент для трансфекции на основе липидов в соответствующем соотношении липидов и ДНК и инкубируйте в соответствии с инструкциями производителя.
- Добавьте 8 мкл смеси липидов: ДНК в предназначенные лунки. Перемешайте содержимое тарелки путем осторожного вращения. Это приводит к трансфекции обоих конструктов экспрессии при 50 нг/лунка.
- Культивировать клетки в течение 20-24 ч в стандартных условиях (37 °C, 5%CO2).
заметка: Культивирование клеток в течение более длительного времени может привести к более высоким уровням экспрессии гибридного белка, что может способствовать неспецифической связи между фрагментами.
2. Средний обмен
- На следующий день замените кондиционированную среду на 100 мкл бессывороточной среды в каждой лунке. Убедитесь, что ячейки не отделились при обмене средой.
заметка: Этот шаг следует проделать за 2-3 ч до добавления рабочего раствора фуримазина. Вывод сыворотки минимизирует фон, вызванный автолюминесценцией фуримазина.
3. Приготовление рабочего раствора фуримазина
- Непосредственно перед измерением смешайте 1 объем фуримазина с 19 объемами буфера для разведения (20-кратное разведение).
заметка: Общий объем готового рабочего раствора фуримазина зависит от количества отдельных анализируемых лунок (рабочий раствор фуримазина добавляют в среду для культивирования клеток в соотношении 1:5, поэтому в каждую лунку, предварительно заполненную 100 мкл бессывороточной среды, следует добавить 25 мкл рабочего раствора фуримазина).
- Добавьте рабочий раствор фуримазина в предназначенные лунки (25 μл/лунка). Аккуратно перемешайте пластину вручную или с помощью орбитального шейкера (например, 15 с при 300-500 об/мин).
4. Измерение люминесценции
- Вставьте пластину в люминесцентный считыватель микропланшетов.
- Для экспериментов, которые должны проводиться при 37 °С, уравновесьте планшет в течение 10-15 минут при указанной температуре.
- Выберите скважины для анализа.
- Считывание люминесценции со временем интегрирования 0,3 с. При необходимости продолжайте контролировать люминесценцию в течение 2 часов.