$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE
1. Протокол MeCP2-ECLIA
- Приготовление промывочного раствора, блокирующего буфера и раствора разбавителя (день 1)
- Добавьте 500 μл Tween 20 к 1 л PBS, чтобы приготовить 0,05% Tween 20 в растворе PBS, энергично перемешайте и пометьте как «моющий раствор».
заметка: Убедитесь, что используется только свежеприготовленный буфер для стирки.
- Приготовьте блокирующий раствор 3% блокиратора А (Таблица материалов) в фосфатно-солевом буфере (PBS). Перемешайте при легком помешивании, процедите, простерилизуйте и храните их в холодильнике до использования максимум две недели.
- Добавьте 5 мл блокирующего раствора к 10 мл PBS для приготовления раствора разбавителя анализа (1% блокатор А в PBS).
- Нанесение покрытий на пластины с высоким связующим
- Выньте 96-луночный многоматричный одноточечный планшет с высоким переплетом.
заметка: Пластины с высоким связыванием имеют большую связывающую способность и, следовательно, больший динамический диапазон, чем стандартные пластины с гидрофобными поверхностями.
- Разморозьте на льду моноклональное мышиное антитело против MeCP2 и смешайте 0,67 мкл антитела с 4 мл PBS (разведение антител 1:6000 в PBS). Вортексируйте раствор антитела, хорошо перемешайте и пометьте пробирку как «раствор для покрытия».
- Осторожно распределите 25 мкл раствора для нанесения покрытия в нижний угол каждой лунки с помощью многоканального дозатора; это называется методом нанесения покрытия раствором. Осторожно постучите по 96-луночной пластине с каждой стороны, чтобы убедиться, что раствор покрытия покрывает дно каждой лунки.
- Запечатайте тарелку клейкой пленкой и выдержите тарелку в холодильнике при температуре 4 °C в течение ночи (12−16 ч).
- Блокировка (день 2)
- Достаньте тарелку из холодильника и снимите фольгу.
- Удалите раствор покрытия антитела, бросив его в корзину для мусора, и постучите пластиной по бумажному полотенцу, чтобы удалить весь раствор покрытия из лунок.
- Добавьте 125 μл блокирующего раствора на лунку. Снова закройте пластину и поместите ее на орбитальный встряхиватель для микропланшетов.
- Инкубировать тарелку в течение 90 мин при комнатной температуре с постоянным встряхиванием при 800 об/мин.
- Подготовка стандартов и образцов
- Во время инкубации подготовьте стандарты белка MeCP2 и/или TAT-MeCP2 и различные образцы.
заметка: Буфер для лизиса, используемый для стандартного разведения, должен быть таким же, как и буфер, используемый в анализируемых образцах.
- Достаньте по одному флакону исходного раствора белка MePC2 и/или TAT-MeCP2 (250 мкг/мл), лизаты мозга мыши и лизаты HDF при температуре -80 °C. Разморозьте их на льду.
- Разбавьте стандартный исходный раствор (MeCP2 и/или TAT-MeCP2) в чистых пробирках в соответствии с таблицей 1.
- Разведите образцы в буфере для лизиса следующим образом: 1−20 мкг лизата мозга мыши на 25 мкл буфера для лизиса и 0,25−1 мкг лизата HDF на 25 мкл буфера для лизиса. Подготовьте достаточный объем каждой пробы, чтобы провести анализ в трех экземплярах.
- Добавление образцов и стандартных решений
- Извлеките блокирующий раствор, бросив его в корзину для мусора, и постучите пластиной по бумажному полотенцу, чтобы удалить весь блокирующий раствор из лунок.
- Промойте пластину 3 раза 150 μл моющего раствора, добавив моющий раствор и немедленно удалив его.
- Добавьте 25 мкл стандартов и образцов в нижний угол лунки с помощью одноканальной пипетки.
- Укупорьте пластину и выдержите ее в течение 4 часов при комнатной температуре с постоянным встряхиванием при 800 оборотах в минуту.
- Немеченые антитела для обнаружения
- Разморозьте на льду поликлональное антитело кролика к MeCP2. Разведите антитело 1:6000 в растворе разбавителя анализа.
- Извлеките стандарты и образцы, бросив их в корзину для мусора, и постучите тарелкой по бумажному полотенцу.
- Промойте пластину 3 раза 150 μл моющего раствора, добавив моющий раствор и немедленно удалив его.
- Добавьте 25 мкл немеченого антитела для обнаружения в каждую лунку с помощью многоканального дозатора. Закройте планшет и выдержите его в течение 1 ч при постоянном встряхивании при 800 об/мин при комнатной температуре.
- Специфические конъюгированные антитела
- Достаньте специфическое вторичное антитело (Таблица материалов) из холодильника и положите его на лед. Разведите антитело 1:666.67 в растворе разбавителя и аккуратно перемешайте.
- Удалите бесплатное немеченое вторичное антитело, бросив его в корзину для мусора, и постучите пластиной по бумажному полотенцу.
- Промойте пластину 3 раза 150 μл моющего раствора, добавив моющий раствор и немедленно удалив его.
- Добавьте 25 мкл специфического конъюгированного антитела (Таблица материалов) в каждую лунку с помощью многоканального дозатора. Укупорьте пластину и инкубируйте в течение 1 ч при постоянном встряхивании при 800 об/мин при комнатной температуре.
- Чтение таблички
- Удалите свободное конъюгированное антитело (Таблица материалов), бросив его в корзину для мусора, и постучите пластиной по бумажному полотенцу.
- Вымойте пластину 3 раза 150 μл моющего раствора.
- Добавьте в пластину 150 мкл 1x Трис-основанного золотого считывающего буфера (Таблица материалов) с поверхностно-активным веществом, содержащим трипропиламин в качестве сореагента для генерации света. Избегайте образования пузырьков воздуха, используя методы обратного пипетирования.
- Поместите пластину на платформу для обнаружения микропланшетов (Table of Materials) и немедленно начните измерение. Используйте настройки для получения 96-луночных планшетов.
- Захват сигналов электрохемилюминесценции встроенной ПЗС-камерой в системе детектирования электрохемилюминесценции (Таблица материалов) и запись количества сигналов, которые соответствуют относительным единицам света (RLU) и прямо пропорциональны интенсивности света.
заметка: При электрохимической стимуляции рутениевая метка, связанная с углеродным электродом, излучает люминесцентный свет с длиной волны 620 нм. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, прилагаемого к прибору (Table of Materials).
Таблица 1: Стандартный ряд от 0 до 1,800 нг/мл.
| стандарт | концентрация | разбавление |
| Стандарт 1 | 1 800 нг/мл | 1,08 мкл Стандартный стоковый раствор + 148,92 мкл Лизисный буфер |
| Стандарт 2 | 600 нг/мл | 50 мкл Стандартный 1 + 100 мкл Лизисный буфер |
| Стандарт 3 | 200 нг/мл | 50 μL Standard 2 + 100 μL Лизисный буфер |
| Стандарт 4 | 66,67 нг/мл | 50 μL Standard 3 + 100 μL Lysis buffer |
| Стандарт 5 | 22,22 нг/мл | 50 μL Standard 4 + 100 μL Лизисный буфер |
| Стандарт 6 | 7,41 нг/мл | 50 μL Standard 5 + 100 μL Lysis buffer |
| Стандарт 7 | 2,47 нг/мл | 50 μL Standard 6 + 100 μL Лизисный буфер |
| Стандарт 8 | 0,82 нг/мл | 50 мкл Стандартный 7 + 100 мкл Лизисный буфер |
| Стандарт 9 | 0,27 нг/мл | 50 мкл Стандартный 8 + 100 мкл Лизисный буфер |
| Стандарт 10 | 0 нг/мл | 150 мкл буфера для лизиса |