Цифровая капельная полимеразная цепная реакция для обнаружения мутаций индела в генах-мишенях

Аннотация

Источник: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-droplet PCR для обнаружения мутаций Indels в генетически модифицированных популяциях комаров Anopheline. J. vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует роль цифровой капельной полимеразной цепной реакции в выявлении мутации индела в образце ДНК. Высокая точность и чувствительность ddPCR позволяют точно и последовательно обнаруживать редкие мутации, присутствующие в образце, даже при низких уровнях. Он может идентифицировать и количественно оценить индель-мутации в различных областях генома, предоставляя ценную информацию о механизмах мутаций и функциональных последствиях этих мутаций.

Протокол

1. Реакции ddPCR и подготовка к генерации капель

1. Количественное определение ДНК с помощью флуориметра.
   заметка: Для анализа отпадения рекомендуется использовать диапазон 3000-30000 копий гаплоидного генома на реакцию, который предназначен для обнаружения событий NHEJ с помощью зонда HEX-мечения, который связывается с последовательностью WT целевого сайта разреза и не отжигает (отслаивает) в случае делеции или вставки в целевом участке. что указывает на наличие варианта NHEJ.
2. Рассчитайте число копий, используя вес гаплоидного генома и концентрацию ДНК в экстракте. Это делается путем умножения концентрации извлеченной ДНК на объем, использованный для получения общей массы ДНК, а затем деления ее на массу гаплоидного генома. Убедитесь, что добавляемый объем составляет от 1 до 10 мкл. Разбавляйте по мере необходимости, чтобы он находился в рекомендуемом диапазоне копий гаплоидного генома.
   заметка: Один гаплоидный геном Anopheles gambiae оценивается в 0,27 пг на одного взрослого комара.
3. Проектные грунтовки и преобразователи. Спроектируйте прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры с температурой плавления праймера (Tm) в диапазоне 55-60 °C, которые обрамляют 5'- и 3'-концы сайта-мишени гРНК, образуя ампликон 150-400.н.
   1. HEX-меченый (гексахлор-флуоресцеин) зонд для обнаружения NHEJ: Спроектируйте олигонуклеотид длиной ~15-20.н., комплементарный целевому сайту, и добавьте HEX-зонд на 5'-конец и BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) на 3'-конец. Tm гидролизного зонда должен быть на 3-10 °C выше, чем Tm грунтовок.
   2. FAM (6-карбоксифлуоресцеин) меченый зонд для референсного WT: Спроектируйте олигонуклеотид длиной ~15-20.н., комплементарный консервативному участку генома, удаленному (около 25.о.) от целевого сайта, и добавьте FAM-зонд к 5'-концу и BHQ1 к 3'-концу. Tm гидролизного зонда должен быть на 3-10 °C выше, чем Tm грунтовок.

2. Подготовка реакции ПЦР

1. Приготовьте 25 μL смеси образцов ddPCR со следующими компонентами: суперсмесь ddPCR для зондов (без UTP): 12,5 μл, прямые и обратные праймеры (10 μM): по 1 μL каждый, зонды HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL каждый, ДНК: 1-5 μL (3 750-37 500 гаплоидных копий генома) и вода: до 25 μL.
2. Тщательно перемешайте реакции с помощью вихревого или рефлюксного пипетирования (вверх и вниз) (20x).
   заметка: Если реакции протекают в 96-луночном планшете, пипетируйте весь объем вверх и вниз 20 раз, а не совершая вихрь, чтобы избежать образования пузырьков.
3. Кратковременно центрифугируйте образцы, чтобы смесь осела на дне пробирки или колодца.
   заметка: Убедитесь, что реакции протекают при комнатной температуре для образования капель. Приготовьте 1x смесь ddPCR для дополнительных/неиспользованных лунок в каждом картридже (в каждом картридже 8 лунок).

3. Генерация капель

1. С помощью многоканальной пипетки объемом 50 мкл загрузите 20 мкл смеси образцов ddPCR в средний ряд картриджа (рис. 1A, вверху).
2. Загрузите 70 μL масла в нижний ряд. Загрузите 20 μл 1x ddPCR supermix в неиспользуемые лунки.
   заметка: Не вводите пузыри.
3. Расположите прокладку так, чтобы она касалась только краев, избегая центральной вогнутой области (рисунок 1B).
4. Надежно поместите пластину в каплегенератор и закройте крышку, чтобы начать работу.
5. С помощью многоканальной пипетки переведите 40 мкл погружной смеси из верхнего ряда картриджа (рис. 1A, внизу) в 96-луночный планшет.
   1. Отбирайте жидкий образец в течение 3-5 с под углом 45-30°. Медленно выдавливайте смесь в течение 3 с под углом 45° в стенку лунки, позволяя ей стекать вниз по стенке. Можно перейти ко второй остановке (полному выталкиванию) пипетки, чтобы вытолкнуть всю жидкость.
6. Используя термосвариватели из фольги, запечатайте пластины на 5 секунд при температуре 180 °C.

4. ПЦР

1. Поместите герметичную пластину в амплификатор (Рисунок 1C) и установите рекомендуемые условия ПЦР, если вы следуете рекомендациям NHEJ по сдаче отходов, следующим образом:
   1. Начальная денатурация при 95 °C в течение 10 мин.
   2. Установите 40 циклов при температуре 94 °C в течение 30 с для денатурации, 55 °C в течение 1 минуты для отжига и при 60 °C в течение 2 минут для расширения.
   3. Подержите при температуре 98 °C в течение 10 минут.
   4. Держать при температуре 4 °C.
      заметка: Температура отжига для конкретных грунтовок и наборов щупов может быть оптимизирована с помощью теплового градиента. Используйте скорость нарастания 2 °C/с для всех этапов. Условия ПЦР должны корректироваться в зависимости от дизайна и установки каждого эксперимента.

5. Чтение капель

1. Надежно поместите пластину в считыватель капель с лункой A-1 в верхнем левом углу (сглаженный угол, остальные три обведены окантовкой) (Рисунок 1D).
2. Настройте пластину в программе: Обозначив FAM в качестве известного опорного канала и HEX в качестве неизвестного (рисунок 2A).
3. Проведите эксперимент по чтению капель в качестве прямой количественной оценки. После завершения выполнения измените тип эксперимента на Drop-Off (DOF) для анализа (рисунок 2A).

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная установка и процедура. (А) Подготовка картриджа к генерации капель. (Вверху) Образцы заполняются в среднем ряду картриджа, в то время как масло заливается в нижнем ряду. (внизу) Верхний ряд заполнен эмульгированными каплями после генерации капель. (В) Генератор капель с картриджем, заполненным образцом и закрытым прокладкой на месте. (

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
ddPCR Super Mix для зондов (без dUTP)	Био-Рад	1863024
ЭДТА (pH 8,0)	Инвитроген	AM9260G
Вода для ПЦР			Можно использовать любую сертифицированную воду для ПЦР
Протеиназа К 20 мг/мл	Thermo Fisher Scientific	АМ2546
материалы
Планшет ddPCR на 96 лунок	Био-Рад	12001925
Картридж и прокладки генератора капель DG8	Био-Рад	1864007
Масло для генерации капель для зондов	Био-Рад	1863005
Флуоресцентные щупы (например, зонды FAM/HEX)	Сигма-Олдрич	Н/Д	Зонды зависят от эксперимента и могут быть приобретены у любого сертифицированного продавца.
Прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры	Сигма-Олдрич	Н/Д	Праймеры специфичны для эксперимента и могут быть приобретены у любого сертифицированного продавца.
оборудование
C1000 Сенсорный термоамплификатор	Био-Рад	1851148	Можно использовать другой термоамплификатор с функцией градиента и глубокой лункой