Градиентная полимеразная цепная реакция для определения оптимальной температуры отжига

Аннотация

Источник: Цудзимото, Х. и др., Обнаружение инделя после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава с высоким разрешением у комаров Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует градиентную полимеразную цепную реакцию для оптимизации температуры отжига грунтов, которая устанавливает температуру градиентного отжига вдоль лунок. Влияние различных температур отжига определяется выходом амплифицированных продуктов, что помогает оптимизировать условия реакции.

Протокол

1. Сканирование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), разработка праймера HRMA и валидация праймера

1. Идентификация SNP у колоний диких типов лабораторных комаров
   1. Выберите целевой экзон, чтобы нарушить правильную трансляцию полипептида.
      заметка: Мишень должна находиться близко к стартовому кодону или среди ключевых остатков, необходимых для функционирования белка. Чем короче экзон (например, ≤200 оснований), тем сложнее его нацелить и проанализировать. Избегайте редактирования близко к границам экзона, так как это заставляет один из праймеров HRMA либо пересекать интрон, либо находиться в интроне. Это нежелательно, потому....

Результаты

Рисунок 1: Идентификация SNP. Схематическое изображение множественного выравнивания последовательностей фрагмента AaeZIP11 из wild-type. Красным цветом выделены SNP, а зеленым — фрагменты, свободные от SNP; этот участок, свободный от SNP, предлагается для дизайна sgRNA и праймеров. Сокращения: SNP = однонуклеотидный полиморфизм; sgRNA = одиночная направляющая РНК; LVP = Ливе.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
70% этанол			70% раствор этанола в воде
96-луночные планшеты для ПЦР и ПЦР в реальном времени	ВВР	82006-636	Для получения геномной ДНК (из лапки комара)
Шаблоны планшетов на 96 лунок			Домашняя печатная, для записи генотипа
Био Рад CFX96	Био Рад		ПЦР-машина с возможностями градиента и HRMA
Диверсифицированные резервуары реагентов Biotech	ВВР	490006-896
Набор для быстрой очистки ПЦР Exo-CIP	Биолаборатории Новой Англии	Е1050С
Стеклянная чашка Петри	ВВР	89001-246	150 мм x 20 мм
Полиолефиново-акрилатная герметизирующая лента Nunc, Thermo Scientific	ВВР	37000-548 (Английский)	Для использования с 96-луночными ПЦР-планшетами для получения геномной ДНК
Набор для прямой ПЦР тканей животных Phire (без инструментов для отбора проб)	Термо Фишер	Ф140ВЧ	Для получения геномной ДНК и проведения ПЦР
Программное обеспечение для прецизионного анализа расплава	Био Рад	1845025	Используется для генотипирования образцов ДНК комаров и анализа свойств термической денатурации двухцепочечной ДНК (см. протокол шаг 3.3)
Одноканальный дозатор	Гилсон
Набор для прямой ПЦР тканей животных Phire (без инструментов для отбора проб)	Термо Фишер	Ф140ВЧ	Для получения геномной ДНК и проведения ПЦР
SeqMan Pro	Программное обеспечение DNAstar Lasergene		Для выравнивания нескольких последовательностей
Одноканальный дозатор	Гилсон