Градиентная полимеразная цепная реакция для определения оптимальной температуры отжига

Аннотация

Источник: Цудзимото, Х. и др., Обнаружение инделя после мутагенеза CRISPR/Cas9 с использованием анализа расплава с высоким разрешением у комаров Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует градиентную полимеразную цепную реакцию для оптимизации температуры отжига грунтов, которая устанавливает температуру градиентного отжига вдоль лунок. Влияние различных температур отжига определяется выходом амплифицированных продуктов, что помогает оптимизировать условия реакции.

Протокол

1. Сканирование однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), разработка праймера HRMA и валидация праймера

1. Идентификация SNP у колоний диких типов лабораторных комаров
   1. Выберите целевой экзон, чтобы нарушить правильную трансляцию полипептида.
      заметка: Мишень должна находиться близко к стартовому кодону или среди ключевых остатков, необходимых для функционирования белка. Чем короче экзон (например, ≤200 оснований), тем сложнее его нацелить и проанализировать. Избегайте редактирования близко к границам экзона, так как это заставляет один из праймеров HRMA либо пересекать интрон, либо находиться в интроне. Это нежелательно, потому что ставки SNP, как правило, намного выше в этих регионах.
   2. Дизайн грунтовки
      1. Перейдите на веб-сайт NCBI Blast - Primer Blast, скопируйте и вставьте выбранный экзон в поле в верхней части страницы | выберите размер продукта ПЦР (убедитесь, что он охватывает большую часть экзона) | выберите организм.
      2. Нажмите на Расширенные параметры | Opt (для продукта для ПЦР Tm) и добавьте 60 (для оптимальной температуры 60 °C) | Приобретите грунтовки. Остальные параметры оставьте по умолчанию.
   3. Получите геномную ДНК (гДНК) из лабораторной колонии дикого типа. Отложите в сторону 10 комаров, обезболите их CO₂ и поместите в чашку Петри на льду, чтобы они не были активны. Установите 10 пробирок, содержащих 0,5 мкл реагента для высвобождения ДНК из ткани и 20 мкл буфера для разведения, которые входят в набор для высвобождения ДНК, предложенный в Таблице материалов.
   4. С помощью щипцов снимите одну ногу с одного комара и поместите ее в соответствующую пробирку с разбавленным раствором реагента с высвобождением ДНК (с шага 1.1.3), полностью погрузив ногу в раствор. Повторите этот шаг с оставшимися комарами, протирая щипцы 70% этанолом, прежде чем приступить к следующему.
   5. Инкубировать раствор, содержащий ножки, при комнатной температуре в течение 2-5 минут, затем при 98 °C в течение 2 минут, и дать ему остыть, пока идет реакция ПЦР><. заметка: Планшеты, содержащие высвобожденную гДНК, могут храниться при температуре -20 °C, и на этом протокол может быть приостановлен.
   6. Приготовьте 10 пробирок, содержащих 10 мкл 2x PCR Master Mix, праймеры до конечной концентрации 0,5 мкМ и молекулярную воду до конечного объема 20 мкл, и перенесите по 1 мкл разбавленного образца в каждую пробирку. Проводите ПЦР с учетом следующих параметров цикла: 98 °C 5 мин, 40 циклов 98 °C в течение 5 с, 60 °C 30 с, 72 °C 20 с / kb; окончательное продление до 72 °C на 1 мин.
   7. Очистите продукты ПЦР с помощью фермента, чтобы разрушить остаточные праймеры ПЦР и дефосфорилировать избыток dNTP или любой набор для очистки колонок. Приступайте к секвенированию образцов.
   8. Проанализируйте каждую электроферограмму на наличие двойных пиков/неоднозначных оснований и вручную отрегулируйте вызовы оснований в каждой последовательности, используя соответствующий код вырожденного основания.
      заметка: Этот шаг должен быть выполнен перед выравниванием нескольких последовательностей, так как обычно программное обеспечение для вызова базы выбирает более заметный пик в качестве «истинного» базового вызова, создавая ложное впечатление об отсутствии SNP.
   9. Выполните выравнивание по нескольким последовательностям с помощью программного обеспечения для выравнивания SeqMan Pro, указанного в Таблице материалов, или другого программного обеспечения для выравнивания с открытым исходным кодом, такого как ClustalW или T-Coffe.
      1. Откройте программу для выравнивания | нажмите «Добавить последовательности» | выберите нужные последовательности и нажмите «Добавить» | После того, как все последовательности выбраны, нажмите «Готово».
      2. Нажмите «Собрать», чтобы выполнить выравнивание. Чтобы открыть выравнивание, нажмите кнопку Contig 1 и проанализируйте выравнивание и определите SNP (рисунок 1).
         заметка: В качестве альтернативы шагам 1.1.3-1.1.6 ПЦР может быть выполнена из изолированной геномной ДНК, полученной из объемных образцов (полученных от >10 особей). Секвенированные ампликоны могут быть непосредственно проанализированы на наличие SNP, проявляющихся в виде двойных пиков на электроферограмме, хотя редкие SNP будет сложнее обнаружить.
   10. Разработайте 3-5 одиночных направляющих РНК (sgРНК), избегая областей, содержащих любые SNP, идентифицированные выше, в соответствии с протоколом, описанным в статье.

2. Дизайн грунтовки HRMA

1. Протестируйте последовательность экзонов на возможное образование вторичных структур во время ПЦР с помощью mFold.
   1. Перейдите на веб-сервер UNAFold | нажмите на mFold | в выпадающем меню, нажмите на Приложения | Форма сворачивания ДНК.
   2. Введите название последовательности в поле и вставьте экзон.
   3. Измените температуру сворачивания на 60 °C; в ионных условиях измените [Mg⁺⁺] на 1,5, а в разделе Единицы переключитесь на мМ; нажмите на Fold DNA.
   4. На выходе, под структурой 1, нажмите на pdf, чтобы открыть графики круговой структуры.
2. Перейдите в NCBI Blast - Primer Blast для разработки грунтовки.
3. Скопируйте и вставьте выбранную последовательность экзонов, определенную с помощью секвенирования на шаге 1.1 (последовательность, которая содержит наименьшее количество SNP или не содержит SNP) в поле в верхней части страницы.
4. С помощью символа < > можно выделить и исключить последовательности, содержащие SNP, целевой сайт и области с возможным образованием вторичной структуры.
5. Выберите размер ПЦР-продукта в диапазоне от 80 до 150.о. и выберите микроорганизм.
   заметка: Можно успешно использовать фрагменты большего размера (~300.о.). Однако более длинные ампликоны могут снижать чувствительность между последовательностями, различающимися по одной или всего нескольким парам оснований.
6. Нажмите на «Получить праймеры». Выберите 2–3 пары праймеров для тестирования (в идеале сайты праймеров должны находиться на расстоянии ≥20–50.о. от любых целевых сайтов CRISPR).

3. Проверка праймера

1. Проведите градиентную ПЦР с использованием гДНК от одного человека.
   1. Подготовьте мастер-микс и удалите одну пробу для нешаблонного контроля (NTC) в отдельную пробирку. Добавьте шаблон к оставшемуся мастер-миксу и аликвотьте в 96-луночную пластину.
   2. Следите за параметрами цикла: 98 °C 30 с, 34 цикла по 98 °C в течение 10 с, 55–65 °C 30 с, 72 °C 15 с; окончательное продление на 72 °C в течение 10 мин.
   3. Создание профилей термического расплава по следующим параметрам: шаг денатурации 95 °C в течение 1 мин, отжиг 60 °C в течение 1 мин, обнаружение кривой расплава в диапазоне от 75 °C до 95 °C с шагом 0,2 °C, с временем выдержки 10 с при каждой температуре><. заметка: Следует использовать только температуры отжига с одним профилем термического расплава.

Результаты

Рисунок 1: Идентификация SNP. Схематическое изображение множественного выравнивания последовательностей фрагмента AaeZIP11 из wild-type. Красным цветом выделены SNP, а зеленым — фрагменты, свободные от SNP; этот участок, свободный от SNP, предлагается для дизайна sgRNA и праймеров. Сокращения: SNP = однонуклеотидный полиморфизм; sgRNA = одиночная направляющая РНК; LVP = Ливе...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
70% этанол			70% раствор этанола в воде
96-луночные планшеты для ПЦР и ПЦР в реальном времени	ВВР	82006-636	Для получения геномной ДНК (из лапки комара)
Шаблоны планшетов на 96 лунок			Домашняя печатная, для записи генотипа
Био Рад CFX96	Био Рад		ПЦР-машина с возможностями градиента и HRMA
Диверсифицированные резервуары реагентов Biotech	ВВР	490006-896
Набор для быстрой очистки ПЦР Exo-CIP	Биолаборатории Новой Англии	Е1050С
Стеклянная чашка Петри	ВВР	89001-246	150 мм x 20 мм
Полиолефиново-акрилатная герметизирующая лента Nunc, Thermo Scientific	ВВР	37000-548 (Английский)	Для использования с 96-луночными ПЦР-планшетами для получения геномной ДНК
Набор для прямой ПЦР тканей животных Phire (без инструментов для отбора проб)	Термо Фишер	Ф140ВЧ	Для получения геномной ДНК и проведения ПЦР
Программное обеспечение для прецизионного анализа расплава	Био Рад	1845025	Используется для генотипирования образцов ДНК комаров и анализа свойств термической денатурации двухцепочечной ДНК (см. протокол шаг 3.3)
Одноканальный дозатор	Гилсон
Набор для прямой ПЦР тканей животных Phire (без инструментов для отбора проб)	Термо Фишер	Ф140ВЧ	Для получения геномной ДНК и проведения ПЦР
SeqMan Pro	Программное обеспечение DNAstar Lasergene		Для выравнивания нескольких последовательностей
Одноканальный дозатор	Гилсон