1. Приготовление смеси для анализа
- Установите исходные концентрации 100 мкмоль/л для всех праймеров в молекулярной воде и зондах в буфере TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды для двух мишеней флуоресцентно помечены различными флуорофорами, как указано в Перечне материалов/оборудования.
- Приготовьте мастер-смесь путем смешивания, на каждую запланированную реакцию, 12 мкл цифровой смеси для ПЦР (2 мкл, см. Список материалов/оборудования), по 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, по 0,06 мкл каждого флуоресцентного зонда и 5,016 мкл безнуклеазной воды (конечная концентрация: 900 нМ на каждый праймер, 250 нМ на зонд). Перемешайте пипетку вверх и вниз не менее 10 раз, стараясь при этом не допустить попадания пузырьков воздуха в раствор.
- Пипетку объемом 18 мкл мастер-смеси (начиная с шага 1.2) в обычную ПЦР-пробирку или планшет, смешивая с матрицей ДНК объемом 6 мкл (экстрагированной, как описано выше) для получения аналитической смеси для генерации капель. При запуске образцов в двух экземплярах в каждую лунку впрыскивайте 36 μл мастер-смеси и 12 μл матрицы ДНК. Оставьте на тарелке пустыми соответствующие лунки реплики. Включайте положительные элементы управления (см. Перечень материалов/оборудования) и не используйте шаблоны управления (NTC) (т.е. с использованием молекулярной воды в качестве шаблона).
заметка: Положительный контроль необходим для того, чтобы убедиться в правильности проведения анализа, а NTC необходим для того, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения внутри планшета и установить флуоресцентный базовый уровень позже при анализе данных. Начинающим пользователям рекомендуется использовать как неразбавленные, так и разбавленные образцы ДНК.
2. Генерация капель и настройка ПЦР-планшета
- Смешайте смеси для анализа, пипетируя вверх и вниз примерно 15 раз с помощью многоканальной пипетки. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки оставался в жидкости, чтобы избежать образования лишних пузырьков в смеси.
- Вставьте картридж 1 (содержащий 8 лунок) в белый держатель картриджа и защелкните держатель картриджа. Картридж 1 теперь прочно закреплен на месте и не может быть выбит из держателя во время образования капель. С помощью многоканального пипета аккуратно перенесите 20 мкл смеси для анализа в среднее положение картриджа с пометкой «Образец», не вводя пузырьков воздуха.
- Нанесите пипетку в 70 мкл масла для генерации капель с левой стороны картриджа (с маркировкой 'Oil').
- Накройте картридж прокладкой, убедившись, что прокладка плоская и равномерно удерживается за 4 тика по направлению к краю картриджа. Нажмите кнопку с зеленым светом на генераторе капель, чтобы открыть и установить картридж. Нажмите кнопку с зеленым светом еще раз, чтобы закрыть генератор.
заметка: Как только дверца закрывается, кнопка затемняется, дверцу нельзя открыть снова, и немедленно начинается образование капель, продолжающееся примерно 1 минуту.
- Если вы выполняете более 8 реакций, поместите картридж 2 во второй белый держатель картриджа и подготовьте так же, как и картридж 1, во время генерации капель, чтобы сэкономить общее время настройки.
- Откройте дверцу генератора капель, когда тускло освещенная кнопка загорится зеленым цветом, указывая на завершение генерации капель. Снимите белый держатель картриджа, содержащий картридж 1, отложите его в сторону и поместите картридж 2 в генератор капель.
- Снимите прокладку с картриджа 1 и выбросьте. Аккуратно перенесите общий объем (примерно 40 мкл) образовавшихся капель из третьего столбца картриджа (с пометкой «Капли») на финальный планшет для ПЦР (поддерживаемый при комнатной температуре) для термоциклирования.
заметка: Не отстегивайте белый держатель картриджа, так как это может привести к поломке вновь образовавшихся капель; Открывайте держатель картриджа только после того, как капли будут перенесены на конечную пластину.
- Повторите шаги 2.1-2.7 для дополнительных образцов.
- Когда все капли окажутся в окончательной ПЦР-пластине, поместите поверх пластины проколотую фольгированную крышку и поместите ее на запайщик пластин. Установите запайщик на 180 °C, нажмите «Play» на запайщике и дайте запайке на 10 секунд.
3. Термоциклирование и чтение капель
- Поместите герметичную пластину на термоамплификатор, совместимый с окончательной ПЦР-пластиной, используемой на шаге 2.7, и со скоростью нарастания температуры 2,0 °C/сек.
- Выполните термопрограмму следующим образом: 10 минут при 95 °C, затем 40 циклов по 30 секунд при 94 °C и 60 секунд при 60 °C, затем 10 минут выдержки при 98 °C (опционально: окончательное удержание при 4 или 15 °C).
- По завершении цикла перенесите планшет в считыватель капель для автоматического измерения флуоресценции в каждой капле в каждой лунке. В качестве альтернативы храните пластину при температуре 4 °C в течение 3 дней до считывания показаний капель. Прежде чем продолжить чтение, убедитесь, что капли находятся при комнатной температуре.
- Откройте прилагаемое программное обеспечение, чтобы настроить считывание капель. В стандартном меню «Настройка», содержащем схему пустой 96-луночной пластины, дважды щелкните по скважине A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: «Образец», «Анализ 1» и «Анализ 2».
- В разделе «Образец» введите идентификатор образца в поле «Имя» и нажмите Enter или установите флажок справа с надписью «Применить». Затем нажмите на выпадающее меню с надписью «Эксперимент» и выберите «КРАСНЫЙ» (обнаружение редких событий) и нажмите Enter.
- Перейдите в раздел с обозначением «Анализ 1». В разделе «Название» заполните анализ (например, Enterococcus) и нажмите Enter. В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на раскрывающееся меню, выберите «Канал 1 неизвестен» и нажмите Enter.
- Перейдите в раздел с обозначением «Анализ 2». В разделе «Название» заполните анализ (например, HF183) и нажмите Enter. В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на раскрывающееся меню, выберите «Канал 2 неизвестен» и нажмите Enter. Вся информация с шагов 3.3.2 по 3.3.4 теперь присутствует в скважине А1.
- Назовите все последующие лунки, содержащие капли. Чтобы сэкономить общее время настройки, нажмите «Shift» или «Ctrl», чтобы выбрать несколько скважин одновременно.
- Когда цифровое изображение номерного знака станет зеркальным отражением физического номерного знака, нажмите «OK» в правом нижнем углу меню. В новом меню, которое появится в верхней части схемы пластины, в разделе «Шаблон» выберите «Сохранить как», а затем назовите и сохраните пластину.
- В левой части экрана нажмите «Выполнить» и выберите подходящий набор красителей во всплывающем окне «Параметры запуска». Сбор данных инициируется и отображается в программном обеспечении в режиме реального времени.
