Дуплексная цифровая ПЦР для одновременного количественного определения двойных генетических маркеров

Аннотация

Источник: Cao, Y., et al. Дуплексный цифровой ПЦР-анализ для одновременного количественного определения Enterococcus spp. и ассоциированный с фекалиями человека маркер HF183 в воде. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео мы демонстрируем метод дуплексной цифровой ПЦР (ddPCR) — модификацию традиционной методики ПЦР, которая полезна для одновременного обнаружения двух разных генетических маркеров. Одна реакция ПЦР разбивается на эмульгированные капли размером в нанолитр, которые амплифицируются независимо друг от друга, а для вычисления начальной концентрации целевых последовательностей используется обнаружение сигналов усиления флуоресценции разного цвета из фракции капель.

Протокол

1. Приготовление смеси для анализа

1. Установите исходные концентрации 100 мкмоль/л для всех праймеров в молекулярной воде и зондах в буфере TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды для двух мишеней флуоресцентно помечены различными флуорофорами, как указано в Перечне материалов/оборудования.
2. Приготовьте мастер-смесь путем смешивания, на каждую запланированную реакцию, 12 мкл цифровой смеси для ПЦР (2 мкл, см. Список материалов/оборудования), по 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, по 0,06 мкл каждого флуоресцентного зонда и 5,016 мкл б....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микротрубки с низким связыванием	Костар	3207	Для хранения реагентов, образцов/производства мастер-смесей
Вода без нуклеазы	Компания FisherSci	БП2484-50
Буфер TE pH 8	Компания FisherSci	БП2473-100
Хардшелл 96-луночный планшет	БиоРад	ХСП-9601	Для начального смешивания и модифицирования образца
Алюминиевая уплотнительная пленка	БиоРад	359-0133 (Английский	Для герметизации пластины с образцом
Генератор капель	БиоРад	186-3002
Масло для генерации капель	БиоРад	186-3005
патрон	БиоРад	186-4008
Держатель картриджа DG8	БиоРад	Тел.: 186-3051
прокладка	БиоРад	186-3009
Наконечники для пипеток 20 мкл	Райнин	ГП-Л10Ф	Для танслинга образца/мастер-микса в картидж
Наконечники для пипеток 200 мкл	Райнин	ГП-Л200Ф	Для переноса капель на конечную пластину Twin.Tec
Планшет Twin.Tec на 96 лунок	Эппендорф	951020320	Для термоциклирования и считывания окончательных капель
Прокалываемая термосвариваемая фольга	БиоРад	181-4040	Для герметизации пластины Twin.Tec перед термоциклированием
Запайщик пластин PX1 PCR	БиоРад	181-4000	Нужен только термоамплификатор, никакой оптики
CFX96 Термоамплификатор	БиоРад	CFX96 и C1000
QX100 Считыватель капель	БиоРад	186-3001
Масло для чтения капель	БиоРад	186-3004
Капельная ПЦР Супермикс	БиоРад	186-3024	т.е. цифровой ПЦР-микс в рукописи
Программное обеспечение QuantaSoft (версия 1.3.2)	Квантасофт	Модель QX100	Для просмотра, анализа и экспорта данных ddPCR
Праймер Entero Forward (Ent F1A)	оперон	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Можно использовать альтернативного поставщика
Entero Обратная грунтовка (Ent R1)	оперон	CAGTGCTCTACCTCCATT	Можно использовать альтернативного поставщика
Зонд Entero (GPL813TQ)	оперон	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Можно использовать альтернативного поставщика, но флуорофор должен быть FAM
HF183 Передний капсюль (HF183-1)	оперон	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Можно использовать альтернативного поставщика
HF183 Обратная грунтовка (BthetR1)	оперон	CGTAGGAGTTTGGACCGT	Можно использовать альтернативного поставщика
Щуп HF183 (BthetP1)	оперон	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC АКАТГГА-[BHQ1]	Можно использовать альтернативного поставщика, но флуорофор должен быть HEX (если используется VIC, то необходимо выбрать соответствующую матричную компенсацию).
Положительный контроль			Смесь геномной ДНК E.faecalis и стандартной плазмиды HF183 (заказана у IDT). Подробные методы культивирования E. faecalis и последовательностей упорядоченной плазмиды HF183 см. в Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Коммерчески доступные стандарты ДНК энтерококка (ATCC 29212Q-FZ) также могут быть использованы в положительном контроле вместо подготовленной в лаборатории геномной ДНК E. faecalis.