Дуплексная цифровая ПЦР для одновременного количественного определения двойных генетических маркеров

Аннотация

Источник: Cao, Y., et al. Дуплексный цифровой ПЦР-анализ для одновременного количественного определения Enterococcus spp. и ассоциированный с фекалиями человека маркер HF183 в воде. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео мы демонстрируем метод дуплексной цифровой ПЦР (ddPCR) — модификацию традиционной методики ПЦР, которая полезна для одновременного обнаружения двух разных генетических маркеров. Одна реакция ПЦР разбивается на эмульгированные капли размером в нанолитр, которые амплифицируются независимо друг от друга, а для вычисления начальной концентрации целевых последовательностей используется обнаружение сигналов усиления флуоресценции разного цвета из фракции капель.

Протокол

1. Приготовление смеси для анализа

1. Установите исходные концентрации 100 мкмоль/л для всех праймеров в молекулярной воде и зондах в буфере TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   ПРИМЕЧАНИЕ: Зонды для двух мишеней флуоресцентно помечены различными флуорофорами, как указано в Перечне материалов/оборудования.
2. Приготовьте мастер-смесь путем смешивания, на каждую запланированную реакцию, 12 мкл цифровой смеси для ПЦР (2 мкл, см. Список материалов/оборудования), по 0,216 мкл каждого прямого и обратного праймера, по 0,06 мкл каждого флуоресцентного зонда и 5,016 мкл безнуклеазной воды (конечная концентрация: 900 нМ на каждый праймер, 250 нМ на зонд). Перемешайте пипетку вверх и вниз не менее 10 раз, стараясь при этом не допустить попадания пузырьков воздуха в раствор.
3. Пипетку объемом 18 мкл мастер-смеси (начиная с шага 1.2) в обычную ПЦР-пробирку или планшет, смешивая с матрицей ДНК объемом 6 мкл (экстрагированной, как описано выше) для получения аналитической смеси для генерации капель. При запуске образцов в двух экземплярах в каждую лунку впрыскивайте 36 μл мастер-смеси и 12 μл матрицы ДНК. Оставьте на тарелке пустыми соответствующие лунки реплики. Включайте положительные элементы управления (см. Перечень материалов/оборудования) и не используйте шаблоны управления (NTC) (т.е. с использованием молекулярной воды в качестве шаблона).
   заметка: Положительный контроль необходим для того, чтобы убедиться в правильности проведения анализа, а NTC необходим для того, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения внутри планшета и установить флуоресцентный базовый уровень позже при анализе данных. Начинающим пользователям рекомендуется использовать как неразбавленные, так и разбавленные образцы ДНК.

2. Генерация капель и настройка ПЦР-планшета

1. Смешайте смеси для анализа, пипетируя вверх и вниз примерно 15 раз с помощью многоканальной пипетки. Следите за тем, чтобы наконечник пипетки оставался в жидкости, чтобы избежать образования лишних пузырьков в смеси.
2. Вставьте картридж 1 (содержащий 8 лунок) в белый держатель картриджа и защелкните держатель картриджа. Картридж 1 теперь прочно закреплен на месте и не может быть выбит из держателя во время образования капель. С помощью многоканального пипета аккуратно перенесите 20 мкл смеси для анализа в среднее положение картриджа с пометкой «Образец», не вводя пузырьков воздуха.
3. Нанесите пипетку в 70 мкл масла для генерации капель с левой стороны картриджа (с маркировкой 'Oil').
4. Накройте картридж прокладкой, убедившись, что прокладка плоская и равномерно удерживается за 4 тика по направлению к краю картриджа. Нажмите кнопку с зеленым светом на генераторе капель, чтобы открыть и установить картридж. Нажмите кнопку с зеленым светом еще раз, чтобы закрыть генератор.
   заметка: Как только дверца закрывается, кнопка затемняется, дверцу нельзя открыть снова, и немедленно начинается образование капель, продолжающееся примерно 1 минуту.
5. Если вы выполняете более 8 реакций, поместите картридж 2 во второй белый держатель картриджа и подготовьте так же, как и картридж 1, во время генерации капель, чтобы сэкономить общее время настройки.
6. Откройте дверцу генератора капель, когда тускло освещенная кнопка загорится зеленым цветом, указывая на завершение генерации капель. Снимите белый держатель картриджа, содержащий картридж 1, отложите его в сторону и поместите картридж 2 в генератор капель.
7. Снимите прокладку с картриджа 1 и выбросьте. Аккуратно перенесите общий объем (примерно 40 мкл) образовавшихся капель из третьего столбца картриджа (с пометкой «Капли») на финальный планшет для ПЦР (поддерживаемый при комнатной температуре) для термоциклирования.
   заметка: Не отстегивайте белый держатель картриджа, так как это может привести к поломке вновь образовавшихся капель; Открывайте держатель картриджа только после того, как капли будут перенесены на конечную пластину.
8. Повторите шаги 2.1-2.7 для дополнительных образцов.
9. Когда все капли окажутся в окончательной ПЦР-пластине, поместите поверх пластины проколотую фольгированную крышку и поместите ее на запайщик пластин. Установите запайщик на 180 °C, нажмите «Play» на запайщике и дайте запайке на 10 секунд.

3. Термоциклирование и чтение капель

1. Поместите герметичную пластину на термоамплификатор, совместимый с окончательной ПЦР-пластиной, используемой на шаге 2.7, и со скоростью нарастания температуры 2,0 °C/сек.
2. Выполните термопрограмму следующим образом: 10 минут при 95 °C, затем 40 циклов по 30 секунд при 94 °C и 60 секунд при 60 °C, затем 10 минут выдержки при 98 °C (опционально: окончательное удержание при 4 или 15 °C).
3. По завершении цикла перенесите планшет в считыватель капель для автоматического измерения флуоресценции в каждой капле в каждой лунке. В качестве альтернативы храните пластину при температуре 4 °C в течение 3 дней до считывания показаний капель. Прежде чем продолжить чтение, убедитесь, что капли находятся при комнатной температуре.
   1. Откройте прилагаемое программное обеспечение, чтобы настроить считывание капель. В стандартном меню «Настройка», содержащем схему пустой 96-луночной пластины, дважды щелкните по скважине A1, чтобы открыть меню, содержащее три раздела: «Образец», «Анализ 1» и «Анализ 2».
   2. В разделе «Образец» введите идентификатор образца в поле «Имя» и нажмите Enter или установите флажок справа с надписью «Применить». Затем нажмите на выпадающее меню с надписью «Эксперимент» и выберите «КРАСНЫЙ» (обнаружение редких событий) и нажмите Enter.
   3. Перейдите в раздел с обозначением «Анализ 1». В разделе «Название» заполните анализ (например, Enterococcus) и нажмите Enter. В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на раскрывающееся меню, выберите «Канал 1 неизвестен» и нажмите Enter.
   4. Перейдите в раздел с обозначением «Анализ 2». В разделе «Название» заполните анализ (например, HF183) и нажмите Enter. В поле ниже с надписью «Тип» нажмите на раскрывающееся меню, выберите «Канал 2 неизвестен» и нажмите Enter. Вся информация с шагов 3.3.2 по 3.3.4 теперь присутствует в скважине А1.
   5. Назовите все последующие лунки, содержащие капли. Чтобы сэкономить общее время настройки, нажмите «Shift» или «Ctrl», чтобы выбрать несколько скважин одновременно.
   6. Когда цифровое изображение номерного знака станет зеркальным отражением физического номерного знака, нажмите «OK» в правом нижнем углу меню. В новом меню, которое появится в верхней части схемы пластины, в разделе «Шаблон» выберите «Сохранить как», а затем назовите и сохраните пластину.
   7. В левой части экрана нажмите «Выполнить» и выберите подходящий набор красителей во всплывающем окне «Параметры запуска». Сбор данных инициируется и отображается в программном обеспечении в режиме реального времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микротрубки с низким связыванием	Костар	3207	Для хранения реагентов, образцов/производства мастер-смесей
Вода без нуклеазы	Компания FisherSci	БП2484-50
Буфер TE pH 8	Компания FisherSci	БП2473-100
Хардшелл 96-луночный планшет	БиоРад	ХСП-9601	Для начального смешивания и модифицирования образца
Алюминиевая уплотнительная пленка	БиоРад	359-0133 (Английский	Для герметизации пластины с образцом
Генератор капель	БиоРад	186-3002
Масло для генерации капель	БиоРад	186-3005
патрон	БиоРад	186-4008
Держатель картриджа DG8	БиоРад	Тел.: 186-3051
прокладка	БиоРад	186-3009
Наконечники для пипеток 20 мкл	Райнин	ГП-Л10Ф	Для танслинга образца/мастер-микса в картидж
Наконечники для пипеток 200 мкл	Райнин	ГП-Л200Ф	Для переноса капель на конечную пластину Twin.Tec
Планшет Twin.Tec на 96 лунок	Эппендорф	951020320	Для термоциклирования и считывания окончательных капель
Прокалываемая термосвариваемая фольга	БиоРад	181-4040	Для герметизации пластины Twin.Tec перед термоциклированием
Запайщик пластин PX1 PCR	БиоРад	181-4000	Нужен только термоамплификатор, никакой оптики
CFX96 Термоамплификатор	БиоРад	CFX96 и C1000
QX100 Считыватель капель	БиоРад	186-3001
Масло для чтения капель	БиоРад	186-3004
Капельная ПЦР Супермикс	БиоРад	186-3024	т.е. цифровой ПЦР-микс в рукописи
Программное обеспечение QuantaSoft (версия 1.3.2)	Квантасофт	Модель QX100	Для просмотра, анализа и экспорта данных ddPCR
Праймер Entero Forward (Ent F1A)	оперон	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Можно использовать альтернативного поставщика
Entero Обратная грунтовка (Ent R1)	оперон	CAGTGCTCTACCTCCATT	Можно использовать альтернативного поставщика
Зонд Entero (GPL813TQ)	оперон	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Можно использовать альтернативного поставщика, но флуорофор должен быть FAM
HF183 Передний капсюль (HF183-1)	оперон	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Можно использовать альтернативного поставщика
HF183 Обратная грунтовка (BthetR1)	оперон	CGTAGGAGTTTGGACCGT	Можно использовать альтернативного поставщика
Щуп HF183 (BthetP1)	оперон	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC АКАТГГА-[BHQ1]	Можно использовать альтернативного поставщика, но флуорофор должен быть HEX (если используется VIC, то необходимо выбрать соответствующую матричную компенсацию).
Положительный контроль			Смесь геномной ДНК E.faecalis и стандартной плазмиды HF183 (заказана у IDT). Подробные методы культивирования E. faecalis и последовательностей упорядоченной плазмиды HF183 см. в Cao et al. 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Коммерчески доступные стандарты ДНК энтерококка (ATCC 29212Q-FZ) также могут быть использованы в положительном контроле вместо подготовленной в лаборатории геномной ДНК E. faecalis.