1. Количественное определение РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра
- Убедитесь, что в настройках спектрофотометра установлено значение РНК.
- Используйте 1-2 мкл молекулярной воды для инициализации машины и установки базового уровня.
- Используйте 1-2 мкл каждого образца исследуемой РНК для оценки количества РНК.
- Сохраните показания и документ.
- При необходимости отрегулируйте РНК до 1 мкг/мкл.
заметка: РНК необходимо постоянно держать на льду (или в прохладном блоке). Если РНК получают с помощью колоночного или гранулированного метода, то РНК обычно составляет менее 1 мкг/мкл. В этой ситуации используйте РНК в чистом виде.
2. Приготовление ряда разведения РНК для определения чувствительности конечной точки
- Произвести 10-кратное серийное разведение РНК.
- Пробирки-метки с сериями разведения (например, 10-1, 10-2 и т.д.) и деталями РНК.
- Добавьте в каждую пробирку 45 μл молекулярной воды.
- Добавьте 5 μL РНК (предварительно разбавленной до 1 μг/μл) и хорошо перемешайте.
- Выбросьте наконечник пипетки в соответствующее дезинфицирующее средство и замените его новым наконечником.
- Возьмите 5 μл из 10-1 и добавьте в тюбик 10-2 и хорошо перемешайте.
- Повторите пункты 2.1.3-2.1.5 с оставшимися разведениями.
ПРИМЕЧАНИЕ: РНК необходимо постоянно держать на льду (или в прохладном блоке).
3. Подготовка реакций ОТ-ПЦР в реальном времени
- Используя электронную таблицу, спланируйте раскладку планшетов в соответствии с количеством тестовых образцов и контрольных образцов как для анализов на лиссавирус, так и для анализов на ß-актин><.
заметка: Если необходимо проверить 4 образца в двух экземплярах с положительным и отрицательным контролем, это составляет 10 реакций для обоих анализов.
- В «чистой комнате» или зоне, отдельной от шаблона РНК, протрите поверхности соответствующим дезинфицирующим средством перед использованием или подготовьте рабочую станцию для ПЦР (если она используется). Чтобы подготовить рабочее место, протрите поверхность шкафа соответствующим дезинфицирующим средством, поместите необходимые предметы в рабочее место и закройте дверцы. Включите ультрафиолетовый свет на 10 минут.
- Извлеките из морозильной камеры регенты и грунтовки и разморозьте (реагенты, перечисленные в таблице 1, и грунтовки в таблице 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь ферментов хранится в глицерине, поэтому не требует размораживания и должна постоянно храниться на льду (или в прохладном блоке). Все остальные реактивы можно размораживать при комнатной температуре.
- После размораживания смешайте реагенты и быстро центрифугируйте для сбора жидкости.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемешивайте смесь ферментов, просто кратковременно центрифугируйте.
- Готовим отдельные мастер-смеси на лиссавирус и ß-актин. Для каждой реакции добавьте 7,55 мкл молекулярной воды, 10 мкл 2x зеленой реакционной смеси Universal SYBR, 0,6 мкл прямого праймера, 0,6 мкл обратного праймера, 0,25 мкл смеси ферментов iTaq RT.
- Используйте электронную таблицу для расчета правильных объемов, чтобы избежать ошибок при ручном расчете. Убедитесь, что подготовлено достаточное количество мастер-смеси для компенсации ошибок пипетирования. Поэтому, если требуется 10 реакций (см. примечание в 3.1), подготовьте 12 реакций
- Приготовьте мастер-микс на льду (или в холодном блоке) и оставайтесь на льду до тех пор, пока не поместите его в машину реального времени.
- Перемешайте подготовленные мастер-смеси, быстро центрифугируйте и распределите 19 μL в соответствующие лунки полосковых пробирок или 96-луночный планшет, совместимый с используемой машиной реального времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сведите к минимуму образование пузырьков в лунках во время пипетирования.
- В отдельном помещении или в УФ-шкафу, подготовленном, как описано в 3.2, осторожно добавьте 1 мкл РНК, предварительно отрегулированной до 1 г/мкл (см. шаг 1.5) под поверхность соответствующей лунки мастер-микса и осторожно перемешайте. Выбросьте наконечник пипетки в дезинфицирующее средство сразу после использования (под поверхность).
- Добавьте контрольные элементы после тестовых образцов, положительный контроль будет добавлен следующим, а контрольный без шаблона (NTC – молекулярная вода) будет добавлен последним. Количество используемой РНК может быть изменено в зависимости от типа образца и используемой экстракции РНК. Используемое количество должно быть проверено, чтобы убедиться в оптимизации реакции.
- Запечатайте пластину с помощью полосовых крышек или герметика, позаботившись о том, чтобы все крышки были плотно закрыты и помечены достаточно, чтобы сориентировать образцы. Нанесите маркировку на край пластины/полосы трубок.
- Раскрутите образцы с помощью центрифуги, чтобы собрать всю жидкость на дне лунок.
- Перенесите планшет в ПЦР-аппарат в режиме реального времени, откройте дверцу и поместите его в держатель, обеспечив правильное расположение/ориентацию образцов в соответствии с расположением планшета.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются трубчатые полоски, убедитесь, что держатель находится на месте.
- Откройте программу ПЦР-аппарата в реальном времени и выберите вариант эксперимента SYBR в реальном времени с кривой диссоциации. Запрограммируйте ПЦР-машину в реальном времени с использованием условий термоциклирования, указанных в таблице 3, включая точки сбора данных.
- Выберите SYBR в качестве флуоресцентного красителя и выберите unknown в качестве типа образца и вставьте имя в поле с правильным именем образца.
заметка: Дифференцировать репликаты, а также между лиссавирусными и β-актиновыми лунками.
- Выберите расположение файла для сохранения экспериментальных данных, убедитесь, что лампа будет выключена в конце прогона, затем запустите прогон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку первым этапом является ступень RT, в течение этого времени данные не собираются, поэтому, если лампе требуется период прогрева, это может произойти во время стадии RT. Машина и программное обеспечение в режиме реального времени будут отображать кривые усиления в режиме реального времени, в то время как кривая плавления будет сгенерирована в конце цикла.
