Количественная ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени для диагностики вирусных инфекций

Аннотация

Источник: Marston, D. A. et al. Pan-lyssavirus Real Time RT-PCR for Rabies Diagnosis. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео демонстрирует количественный метод обнаружения вирусной инфекции с помощью ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. На этапе обратной транскрипции РНК преобразуется в кДНК, которая затем амплифицируется с помощью циклов ПЦР. Наличие вирусной РНК в образце подтверждается анализом кривых амплификации и диссоциации ДНК, полученных в результате ПЦР.

Протокол

1. Количественное определение РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра

1. Убедитесь, что в настройках спектрофотометра установлено значение РНК.
2. Используйте 1-2 мкл молекулярной воды для инициализации машины и установки базового уровня.
3. Используйте 1-2 мкл каждого образца исследуемой РНК для оценки количества РНК.
4. Сохраните показания и документ.
5. При необходимости отрегулируйте РНК до 1 мкг/мкл.
   заметка: РНК необходимо постоянно держать на льду (или в прохладном блоке). Если РНК получают с помощью колоночного или гранулированного метода, то РНК обычно составляет менее 1 мкг/мкл. В этой ситуац....

Результаты

Таблица 1: Реагенты мастер-смеси ОТ-ПЦР в режиме реального времени Pan-lyssavirus.

реагент	μл/реакция
Молекулярная вода	7.55
2x Универсальная реакционная смесь для ОТ-ПЦР	10
Праймер Форвард [20 μM]	0,6
Обратная грунтовка [.......

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Наконечники для пипеток Art Barrier (различные размеры)	Термофишер	различный
центрифуга	Бэкмен	Аллегра 21Р	Требуется ротор, способный вместить 96 луночных планшетов. Шаг 3.8.
Центрифуга (микро)	сигма
Финнпипетки (для дозирования 0,5-1000 μл)	Термофишер	различный
iTaq Universal SYBR Green Одношаговый набор для ОТ-ПЦР	Био-Рад	Телефонный номер: 172-5150	Эквивалентные комплекты могут быть использованы в случае валидации
MX3000P или MX3005P системой ПЦР в реальном времени	Стратагена	Н/Д	При проверке можно использовать эквивалентные машины
Основание реакционной пластины MicroAmp	Любой подходящий		Используется для надежного удержания трубной полоски и пластин.
Оптически прозрачные плоские прозрачные полоски (8)	ABgene	АБ-0866
Идеальная рама (при использовании трубчатых полос)	Стратагена	Н/Д	Специально для машины
Грунтовки: подробную информацию о грунтовке см. в таблице 2.			Заказывается по 0,05 мкм по шкале ВЭЖХ очищенной.
Термобыстрые 96-луночные планшеты, без юбки	ABgene	АБ-600
Термобыстрые стрипы (8) Термотрубки	ABgene	АБ-0452
Вихревая машина / Whirlimixer	Научное оборудование Fisons	СГП-202-010Дж
Если не указано иное, можно использовать альтернативное оборудование