Блокирующая ПЦР дикого типа для выявления низкочастотных соматических мутаций

Аннотация

Источник: Albitar, A. Z. et al., Блокирующая ПЦР дикого типа в сочетании с прямым секвенированием как высокочувствительный метод обнаружения низкочастотных соматических мутаций. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает блокирующую полимеразную цепную реакцию дикого типа, или WTB-PCR, которая обнаруживает соматические мутации. В методе, основанном на ПЦР, используется заблокированная нуклеиновая кислота, или LNA, олигонуклеотид, который связывается с его комплементарным аллелем дикого типа и блокирует его удлинение. Блокирование избирательно позволяет амплификацию низкоуровневых мутантных аллелей по их вариантам дикого типа в образце.

Протокол

1. Экстракция ДНК из ткани FFPE, периферической крови и аспирата костного мозга

1. Для ткани FFPE костного мозга с помощью набора для экстракции DNA FFPE
   1. Начните с FFPE ткани из неокрашенных предметных стекол (5 - 10 срезов толщиной 5 - 10 мкм).
      заметка: Если вы начинаете с тканевой стружки, используйте 3 - 6 срезов при толщине 5 - 10 мкм и перейдите к шагу 1.1.6.
   2. Поместите предметные стекла в корзину для слайдов и подготовьте четыре резервуара для промывки (два для ксилола и два для 100% спирта). Добавьте в каждую корзину минимальный объем 600 мл раствора.
   3. Депарафинизируйте предметные стекла, промыв ксилол в первом лотке за 5 минут. Перенесите предметные стекла во второй резервуар для промывки ксилола еще на 5 минут.
   4. После депарафинизации промойте стекла 100% спиртом в течение 5 мин. Перенесите стекла во второй резервуар для промывки спирта еще на 5 мин.
   5. Дайте предметным стеклам полностью высохнуть под капюшоном, прежде чем соскрести их лезвием бритвы в микроцентрифужную пробирку.
      заметка: Если имеется предметное стекло с указанной областью опухоли, выровняйте предметные стекла и соскребите только область опухоли.
   6. Следуйте инструкциям из раздаточного материала производителя, входящего в комплект.
2. Для аспирата КМ и периферической крови
   1. Выписка производится в соответствии с инструкциями производителя, раздаточным материалом с этими характеристиками.
      заметка: Существует множество коммерчески доступных наборов и методов для экстракции ДНК из тканей и клеток FFPE. Практически можно использовать все. Используйте метод, который налажен в лаборатории.
      1. Используйте 200 μL периферической крови (PB) или 100 μL BM + 100 μL PBS.
      2. Используйте стоковый раствор РНКазы А объемом 4 мкл.
      3. Элюируйте с помощью элюирующего буфера объемом 100 μL.
3. Количественная оценка ДНК
   1. Измерьте концентрации ДНК с помощью спектрофотометра, обеспечивая соотношение 260 нм/280 нм примерно 1,8 (для чистой ДНК). Если это соотношение заметно ниже, это может указывать на наличие белка, фенола или других загрязняющих веществ, которые могут мешать последующему применению.
   2. Отрегулируйте концентрацию ДНК примерно до 50 - 100 нг/мкл с помощью соответствующего буфера для элюирования.

2. ПЦР с блокировкой вайлд-типа

1. Дизайн грунтовки
   1. Проектируйте и получайте праймеры для интересующих генов в соответствии с ранее описанными общими рекомендациями по дизайну ПЦР-праймеров. Включите в праймеры для ПЦР праймеры для прямого и обратного секвенирования M13.
      заметка: Анализ MYD88 был разработан для амплификации экзона 5 MYD88 (G259 - N291) и 110 нуклеотидов, расположенных в 5'-интронной области, чтобы покрыть сайт сплайсинга и часть интрона 4. Прямые и обратные капсюли были спроектированы в соответствии с последовательностью 5'-M13 (M13- forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverse: cag gaa aca gct atg acc) для обеспечения отжига дополнительных капсюлей для секвенирования (см. таблицу материалов).
2. Дизайн заблокированных олигонуклеотидов нуклеиновых кислот
   1. Спроектируйте блокирующий олигонуклеотид так, чтобы он имел длину примерно 10 - 15 оснований и был комплементарен матрице WT, где желательно обогащение мутантами.
      заметка: Более короткий олиго улучшит распознавание несоответствия. Для достижения высокой специфичности мишени важно не использовать слишком много блокирующих нуклеотидов, так как это может привести к образованию очень «липкого» олигонуклеотида. Содержание, длина и блокирующий нуклеотид должны быть оптимизированы в соответствии с конкретным нуклеотидом, который необходимо блокировать. Важно достичь высокой специфичности связывания без ущерба для вторичной структуры и риска самокомплементарности.
   2. Спроектируйте блокирующий олиго таким образом, чтобы температура T_m на 10 - 15 °C превышала температуру расширения во время термоциклирования. Регулируйте T_m путем добавления или удаления блокирующих оснований или путем замены ДНК блокирующими основаниями, избегая при этом длинных отрезков (3-4 основания) блокирующих оснований G или C.
      1. Перейдите на веб-сайт инструментов Oligo (см. Таблицу материалов) и выберите инструмент «Блокировка прогнозирования Oligo T_m».
      2. Вставьте последовательность шаблона WT, которую необходимо заблокировать, в поле "Последовательность олиго". Добавьте «+» перед базами, чтобы обозначить блокирующие базы.
      3. Нажмите кнопку «Рассчитать», чтобы определить примерное T_m гибрида ДНК-блокатора.
   3. Спроектируйте блокирующий олиго, чтобы избежать образования вторичной структуры или самодимеров.
      1. Перейдите на веб-сайт инструментов Oligo (см. Таблицу материалов) и выберите инструмент «Оптимизатор блокировки Oligo».
      2. Вставьте в поле последовательность шаблона WT, которую необходимо заблокировать. Добавьте знак «+» перед базами, чтобы обозначить блокирующие базы.
      3. Выберите два поля для "Второстепенная структура" и "Только для себя". Нажмите кнопку Анализ, чтобы просмотреть олиго на предмет потенциально проблемных вторичных структур или самодимеров.
         заметка: Баллы представляют собой очень грубые оценки T_m вторичных структур и автодимеров. Таким образом, более низкие баллы являются оптимальными и могут быть достигнуты путем ограничения пары блокатор-блокатор. Блокирующий олигонуклеотид для MYD88 [блокатор MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+T+CC/invdT/)] был разработан для покрытия аминокислот Q262-I266 и имеет 3'-инвертированный dT для ингибирования обоих расширений ДНК-полимеразой и деградации 3'-экзонуклеазой. Этот специфический блокирующий олиго представляет собой 17 мер с 10 блокирующими основаниями, которые обозначаются как «+N». Остальные 7 оснований являются обычными нуклеотидами ДНК.
3. Настройка и термоциклирование ВТБ-ПЦР
   1. Приготовьте мастер-смесь WTB-PCR (MMX) с использованием 2,5 мкл реакционного буфера для ПЦР 10x с 20 мМ MgCl₂, 250 мкМ dNTPs, 0,2 мкМ прямого и обратного праймера, 1,2 мкМ блокатора MYD88 и ДНКазы, не содержащей РНКазы, сверхчистого H₂O для получения конечного объема раствора 21,75 мкл на реакцию.
      заметка: Рабочие концентрации приведены для конечного объема реакции 25 мкл (после добавления матрицы ДНК и полимеразы). Обычная ПЦР ММХ готовится путем простого исключения добавления блокатора. Все этапы протокола остаются идентичными как для WTB, так и для обычной ПЦР. Это может быть использовано для валидации и определения обогащения, достигнутого за счет добавления блокатора.
      1. При расчете количества MMX для приготовления обязательно учитывайте 3 дополнительные реакции (положительный и отрицательный контроль и нешаблонный контроль для проверки на загрязнение) и по крайней мере 1 дополнительную реакцию на ошибку пипетирования.
   2. Вортексируйте MMX основательно. MMX может храниться при температуре -80 °C до года.
   3. Добавьте 0,25 мкл Taq ДНК-полимеразы для каждой реакции в MMX и перемешайте. После того, как полимераза была добавлена в MMX, держите ее на льду.
   4. Поместите новый 96-луночный ПЦР-планшет на холодную пластину и пипетируйте 22 мкл MMX с полимеразой в каждую реакционную лунку.
   5. Добавьте 3 мкл геномной ДНК (50 - 100 нг/мкл) в каждую из лунок, содержащих MMX с полимеразой.
   6. Ненадолго закройте планшет и центрифугу, чтобы раствор достиг дна каждой лунки.
   7. Загрузите планшет для ПЦР в термоамплификатор.
      1. Установите следующие условия термоциклирования для реакции ВТБ-ПЦР следующим образом: начальная денатурация при 95 °С в течение 6 мин; 40 циклов денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг праймера при 56 °С в течение 30 с и удлинение при 72 °С в течение 1 мин 20 с; окончательное удлинение при 72 °С в течение 10 мин.<бр/> заметка: Наилучшей практикой является завершение оставшейся части протокола в физически отдельной зоне, чтобы избежать загрязнения ампликонами в будущих установках.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микроцентрифужные пробирки Safe-Lock объемом 1,5 или 2 мл	Эппендорф	Тел.: 05-402-25
100% спирт	ВВР	89370-084	Степень гистологии: 91,5% этанол, 5% изопропиловый спирт, 4,5% метиловый спирт
Алюминиевая уплотнительная пленка	ГенМейт	Т-2451-1	Для ПЦР и холодного хранения
Центрифуга серии 5804	Эппендорф		Ротор A-2-DWP (для планшета для ПЦР)
Холодный планшет для 96-луночных планшетов	Эппендорф	Z606634
ДНКаза, РНКаза, сверхчистая вода
dNTP (100 мМ)	Инвитроген	10297-117
Абсолют этанола	сигма	Е7023	200 пруф, для молекулярной биологии
Веб-сайт Exiqon Oligo Tools			http://www.exiqon.com/oligo-tools
ДНК-полимераза FastStart Taq (5 Ед/мкл)	Рош	12032937001	С 10x концентрированным буфером для ПЦР-реакции, с 20 мМ MgCl2
Аппарат для гель-электрофореза			2% агарозный гель
Олигонуклеотид ЛНА	Эксикон	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A +T+CC/invdT/ (+N = базы LNA)
Амплификатор Mastercycler Pro S Термоамплификатор	Эппендорф	E950030020
Микроцентрифуга Модель 5430	Эппендорф		Ротор FA-45-30-11 (для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5/2 мл)
Спектрофотометр NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific
Прямой праймер ПЦР	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
Обратный праймер для ПЦР	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
ПЦР-планшеты	ГенМейт	Т-3107-1
Пипетки			20, 200, 1 000 μл
Мини-набор QIAamp DNA	Цягэн	51304	Для аспирата КМ и периферической крови
Вихревой джинн	Научные отрасли	СИ-0236
Корзина с горками