Количественная полимеразная цепная реакция для перечисления бактериофагов

Аннотация

Источник: Peng, X., et al., Количественная ПЦР бактериофага Т7 из биопанорамирования. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео мы обсуждаем количественную полимеразную цепную реакцию, qPCR, для перечисления бактериофагов T7 с помощью количественного определения ДНК. Флуоресцентный краситель в смеси ПЦР связывается с вновь синтезированными нитями ДНК и излучает флуоресценцию, которая измеряется.

Протокол

1. Подготовка реакций qPCR

ПРИМЕЧАНИЕ: Одна реакция ПЦР предназначена для одного образца. Каждая ПЦР-реакция содержит 5 мкл мастер-смеси для количественной ПЦР (см. материалы), 1 мкл смеси праймерных пар 5 мкМ, 2 мкл H₂O и 2 мкл термически обработанного образца фага T7. Для множественных реакций ПЦР все реагенты, кроме образца фага, предварительно смешиваются в одной пробирке объемом 1,5 мл. Объем каждого реагента в премиксе зависит от количества фаговых образцов для количественной ПЦР.

1. Приготовьте премикс для количественной ПЦР для 10 биопанированных образцов фагов неизвестной концентрации и 7 образцов стандартных концентраций в трех экземплярах. В результате получается 51 образец и, следовательно, 51 реакция количественной ПЦР (т.е. одна реакция на образец). Для 51 реакции приготовьте премикс из 255 мкл мастер-смеси для количественной ПЦР (51x 5 μл), 51 μл праймеров (51x 1 μл) и 102 μл H₂O (51x 2 μл).
   заметка: Рекомендуется подготовить несколько дополнительных реакций ПЦР, чтобы компенсировать потерю объема при аликвотировании ПЦР-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета для количественной ПЦР.
2. Введите 8 мкл предварительного микса для ПЦР в каждую лунку 96-луночного планшета для количественной ПЦР, что в общей сложности составляет 51 лунку (т.е. 51 реакцию количественной ПЦР). Нет необходимости менять чаевые во время аликвотирования.
3. Добавьте 2 мкл термически обработанных образцов фага Т7 или референсной ДНК фага Т7 в каждую лунку (рис. 1B); меняйте наконечники при добавлении различных образцов ДНК в лунку, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение. Кроме того, диспонируйте образцы ДНК объемом 2 мкл под поверхностью предварительного микса для количественной ПЦР (т.е. в премикс для ПЦР объемом 8 мкл).
4. Запечатайте планшет для количественной ПЦР клейкой пленкой.
   заметка: Этот шаг имеет решающее значение, независимо от типа планшета для количественной ПЦР. Используйте рекомендованный комплект, чтобы полностью герметизировать пластину; в противном случае любая незапечатанная область в планшете приведет к потере объема во время цикла ПЦР.
5. Оберните планшет для количественной ПЦР алюминиевой фольгой, чтобы свести к минимуму флуоресцентное фотообесцвечивание, и приступайте к его запуску на оборудовании для количественной ПЦР.

2. Условия цикла qPCR

ПРИМЕЧАНИЕ: условия цикла количественной ПЦР были настроены на конкретном оборудовании для количественной ПЦР.

1. Запустите 96-луночный планшет для количественной ПЦР на оборудовании для количественной ПЦР. На оборудовании выберите в меню настройки, чтобы задать следующие условия эксперимента (рисунок 1С).
2. Для образца объемом 10 мкл установите следующие условия цикла: один цикл при 50°C в течение 2 мин, один цикл при 95°C в течение 2 мин, затем 40 циклов (95°C в течение 15 с, 60°C в течение 1 мин). После этого запустите настройки кривой расплава: один цикл 95°C в течение 15 с, 60°C в течение 1 мин и 95°C 15 с.
3. Приступайте к анализу данных.

Результаты

Рисунок 1: Обработка фагового образца, подготовка реакции количественной ПЦР и запуск количественной ПЦР. Предварительно обработанные образцы фагов ДНКазы I Т7 нагревали до 100°С в течение 15 мин для высвобождения ДНК Т7 из интактных фаговых частиц (А); смесь для количественной ПЦР готовили, как описано в протоколе. Все приготовления проводились на льду (А); Оборудов...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Праймеры для геномной ДНК Т7	IDT		F: CCTCTTGGGAGGAAGAGATTTG R: TACGGGTCTCGTAGGACTTAAT
T7 Select контроль упаковки DNA	EMD Millipore	69679-1УГ
Оптический 96-луночный реакционный планшет MicroAmp	ThermoFisher Scientific	N8010560
qPCR master mix-Power up SYBR Green master mix	Прикладные биосистемы	Прикладные биосистемы
Комплект оптической адгезивной пленки MicroAmp	ThermoFisher Scientific	ThermoFisher Scientific
Ультрачистый ДНКаза/РНКаза дистиллированный H2O	Инвитроген	10977015
Система ПЦР в реальном времени ViiA7 с быстрым блоком на 96 лунок	ThermoFisher Scientific	4453535
Программное обеспечение для ПЦР в реальном времени QuantStudio	ThermoFisher Scientific		Версия 1.2