$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Асимметричная ПЦР для амплификации одноцепочечной ДНК
- Приготовьте асимметричную смесь реагентов ПЦР для амплификации одноцепочечной ДНК, подлежащей анализу. Разморозьте реагенты, указанные в таблице 1, на льду. Не храните фермент Taq-полимеразу (50 Ед/мкл) на льду, а храните его при температуре 20 °C до тех пор, пока он не понадобится.
- Аккуратно перебейте все реагенты вихрем, а затем кратковременно центрифугируйте пробирки при давлении 10 000 x g в течение 10 с.
- Объедините все реагенты, как описано в таблице 1.
- Поместите образцы в амплификатор и запустите асимметричную ПЦР в следующих условиях: 25 циклов (95 °C в течение 30 с, 52 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с), 85 °C в течение 5 мин, держать при 4 °C.
2. Микросфера-ПЦР для амплификации одноцепочечной ДНК
>ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается протокол амплификации ssDNA в реакционной пробирке ПЦР. Реакции микросфера-ПЦР проводили в объеме 50 мкл реакции. Подробные последовательности, используемые для амплификации одноцепочной ДНК, перечислены в таблице 2. В этом случае Ap на поверхности микросфер может отжигать на случайные матрицы ДНК комплементарным образом. Это очень важный этап для получения комплементарных нитей ДНК (антисмысловая цепь ДНК, рис. 1). Расширенная ДНК используется в качестве матрицы для амплификации микросфер с помощью ПЦР.
- Приготовьте смесь реагентов микросфера и ПЦР. Разморозьте реагенты, указанные в таблице 3, на льду; однако не держите фермент Taq-полимеразу на льду. Храните при температуре -20 °C до тех пор, пока не понадобится.
- Аккуратно перебейте все реагенты вихрем, а затем кратковременно центрифугируйте пробирки при давлении 10 000 x g в течение 10 с.
- Получите примерно ~25 микросфер с помощью микроскопического подсчета.
заметка: Количество микросфер в одной реакционной пробирке рассчитывается с помощью светового микроскопа с 40-кратным увеличением. Около ~25 микросфер используются для амплификации микросфер с помощью ПЦР. Более подробная информация находится в Шаге 3.
- Объедините все реагенты, как описано в таблице 3.
- Поместите образцы в амплификатор и запустите асимметричную ПЦР в следующих условиях: 25 циклов (95 °C в течение 30 с, 52 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с), 85 °C в течение 5 мин, держать при 4 °C.
- После амплификации добавьте 8 мкл 6-кратного загрузочного буфера и загрузите по 15 мкл каждого образца в 2% агарозный гель. Затем проведите электрофорез при напряжении 100 В в течение 35 мин в 1x TAE (Трис-ацетат-ЭДТА, 40 мМ Трис-ацетат, 1 мМ ЭДТА, pH 8,2) буфере.
Таблица 1. Асимметричные компоненты смеси реагентов ПЦР в реакции 20 μл.
вперед
мм
| реагент | Объем для 1x реакции (μл) | Конечная концентрация |
| Случайный шаблон ДНК | 1 | 1 нг/мкл |
| Грунтовка с прокладкой | 1 | 0,4 μМ |
| Обратный праймер | 1 | 0,02 мкМ |
| 10-кратный буфер Taq | 5 | В 1 раз |
| 10 мМ dNTP | 4 | 2,5 мМ |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 У |
| Вода | 37,8 | - T |
| итог | 50 | - T |
Таблица 2. Информация о последовательностях для «Микросфера-ПЦР».
| шаблон | последовательность | Длина (nt) |
| Случайный шаблон ДНК | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Случайная последовательность, 40 мер) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Грунтовка Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Обратный праймер | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA CTA-3' | 18 |
Таблица 3. Компоненты смеси реагентов микросфера и ПЦР в реакции 50 мкл
мм
| реагент | Объем для 1x реакции (μл) | Конечная концентрация |
| Ап-микросферы | ~25 микросфер | - T |
| Случайный шаблон ДНК | 1 | 1 нг/мкл |
| Грунтовка Tag-Forward | 1 | 0,4 μМ |
| 10-кратный буфер Taq | 5 | В 1 раз |
| 10 мМ dNTP | 4 | 2,5 мМ |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 У |
| Вода | 37,8 | - T |
| итог | 50 | - T |
