Микросферная полимеразная цепная реакция для амплификации одноцепочечной ДНК

Аннотация

Источник: Lee, S. H. et al., Микрофлюидный подход на основе капель и микросферная ПЦР-амплификация для одноцепочечных ампликонов ДНК. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает технику амплификации одноцепочечной ДНК с использованием полимерных микросфер, покрытых олигонуклеотидами, в однотрубной реакции. В результате этого процесса получается чистая одноцепочечная ДНК, которая в дальнейшем может быть использована для секвенирования ДНК и анализа микрочипов.

Протокол

1. Асимметричная ПЦР для амплификации одноцепочечной ДНК

1. Приготовьте асимметричную смесь реагентов ПЦР для амплификации одноцепочечной ДНК, подлежащей анализу. Разморозьте реагенты, указанные в таблице 1, на льду. Не храните фермент Taq-полимеразу (50 Ед/мкл) на льду, а храните его при температуре 20 °C до тех пор, пока он не понадобится.
2. Аккуратно перебейте все реагенты вихрем, а затем кратковременно центрифугируйте пробирки при давлении 10 000 x g в течение 10 с.
3. Объедините все реагенты, как описано в таблице 1.
4. Поместите образцы в амплификатор и запустите асимметричную ПЦР в следующих услов....

Результаты

Рисунок 1: Иллюстрация протокола микросфера-ПЦР.

....

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
40% Акриламид:бис раствор (19:1)	Био-рад	1610140	Компоненты сополимеризуемой олигомикросферы
Персульфат аммония, АФС	Сигма Олдрич	А3678	Отвердитель акриламида:бис раствор
N,N,N',N'-Тетраметилэтилендиамин, TEMED	Сигма Олдрич	Т9281	Катализатор персульфата аммония
нефтепродукт	Сигма Олдрич	М5904	Таблица 1. Решение III. Компонент микросферных реагентов
Зонд, меченный акридитом ssDNA	Бионер	синтезированный	Таблица 1. Раствор I. Компонент микросферных реагентов
Трис	Биосесанг	Т1016	Компоненты буфера TE, буферного раствора pH
Эдта	Сигма Олдрич	ЭЦП	Компоненты TE буфера, удаление ионов (Ca2+)
Ex Taq	Такара	РР001А	Амплификация одноцепочных ДНК
Термоамплификатор T100	Био-рад	1861096	Амплификация одноцепочных ДНК