$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Обратная транскрипция вирусной РНК
- Извлеките из морозильной камеры реагенты RT, перечисленные в таблице 1, держите их на льду, а перед использованием разморозьте и
обогните.
- Приготовьте 12 мкл реакционной смеси RT в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл с реагентами, перечисленными в таблице 1. Допускайте вариации пипетирования, приготовив объем исходной смеси по крайней мере на один размер реакции, превышающий требуемый.
- Добавьте образец объемом 8 мкл, положительную контрольную РНК или отрицательную контрольную РНК в смесь реакции ОТ на рабочей станции ПЦР в комнате для шаблонов. Положительным контролем ОТ является РНК, выделенная из клеточной культуры, инфицированной фиксированным штаммом RABV CVS-11 (стандарт вируса-11) и хранящаяся при -80°C. Отрицательный контроль содержит не содержащий РНКазы ddH2O.
- Смешайте содержимое пробирок RT путем вершинирования, затем кратковременно центрифугируйте.
- Загрузите реакционные пробирки в термоамплификатор. Настройте программу синтеза кДНК при следующих условиях: 42°C в течение 90 мин, 95°C в течение 5 мин и 4°C в режиме ожидания. Установите объем реакции на 20 μл. Запустите RT.
2. ПЦР первого раунда
- Храните ПЦР-реагенты, перечисленные в таблице 2, на льду в чистом помещении до использования, затем разморозьте и закрутите их.
- Приготовьте смесь для первого раунда ПЦР в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл с реагентами, перечисленными в таблице 2.
- Добавьте образец кДНК или плазмиды объемом 2 мкл в смесь первого раунда ПЦР на рабочей станции ПЦР в комнате для шаблонов. Положительным контролем ПЦР является кДНК CVS-11, полученная, как указано на шаге 1.3 для вышеуказанного метода ОТ. Отрицательный результат ПЦР – dd H2O.
- Перенесите герметичные пробирки в термоамплификатор для ПЦР и выполните цикл с параметрами, перечисленными в таблице 3.
3. ПЦР второго раунда
- Приготовьте смесь для ПЦР второго раунда в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4.
- Добавьте 2 мкл продукта ПЦР первого раунда в смесь для ПЦР второго раунда. Кроме того, следует включить ддН2О в качестве отрицательного контроля ПЦР второго раунда.
- Выполните термоциклирование ПЦР с использованием тех же параметров, которые приведены в шаге 2.4.
Таблица 1: Реагенты обратной транскрипции для синтеза кДНК.
| компонент | Объем за реакцию (μл) |
| dNTP (2,5 мМ) | 4 |
| Случайный праймер (50 мкМ) | 1.5 |
| Олиго(dT) 15 (50 мкМ) | 0,5 |
| Буфер M-MLV (5 шт.) | 4 |
| M-MLV обратная транскриптаза (200 МЕ/мкл) | 1 |
| РНКазин (40 МЕ/мкл) | 1 |
| Общий объем | 12 |
Таблица 2: Реагенты ПЦР первого раунда.
мм
| компонент | Объем за реакцию (μл) |
| dNTP (10 мМ) | 1 |
| Экс-Taq (5 Ед/μл) | 0,3 |
| Буфер Taq (10 шт.) | 5 |
| N127 (20 мкМ) | 1 |
| N829 (20 мкМ) | 1 |
| дд Н2О | 39,7 |
| Общий объем | 48 |
Таблица 3: Циклические параметры ПЦР первого и второго раундов
| температура | Время | цикл |
| 94 °C | 2 мин | 1 |
| 94 °C | 30 с | 35 |
| 56 °C | 30 с | 35 |
| 72 °C | 40 с | 35 |
| 72 °C | 10 мин | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Таблица 4: Реагенты ПЦР второго раунда.
мм
| компонент | Объем за реакцию (μл) |
| dNTP (10 мМ) | 1 |
| Экс-Taq (5 Ед/μл) | 0,3 |
| Буфер Taq (10 шт.) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| дд Н2О | 39,7 |
| Общий объем | 48 |