Методическая статья

ПЦР плавления с высоким разрешением для определения вариаций последовательностей в мутантных последовательностях ДНК

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Kisserli, A., et al. ПЦР с высоким разрешением для генотипирования полиморфизма длины рецептора комплемента 1: инновационный инструмент для оценки восприимчивости к генам болезни Альцгеймера. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео мы описываем метод ПЦР с высоким разрешением для определения полиморфизма длины фрагментов ДНК различной длины последовательности на основе анализа температуры плавления.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Протокол HRM-PCR

  1. Разморозьте образцы ДНК. Разведите образцы ДНК в пробирках объемом 1,5 мл с водой, чтобы довести их до концентрации 10 нг/мкл
    заметка: Общий объем разбавленной ДНК должен составлять от 2 до 10 литров.
  2. Разморозьте грунтовочные растворы. Растворы праймеров в пробирках объемом 1,5 мл разбавляют водой, чтобы довести их до той же концентрации 6 мкМ<бр/> заметка: Последовательности праймеров и условия реакции приведены в таблице 1.
  3. Разморозьте растворы наборов HRM-PCR и тщательно перемешайте путем вортексирования, чтобы обеспечить восстановление всего содержимого. Перед открытием на короткое время поверните три флакона, содержащие ферментативную смесь с ДНК-связывающим красителем MgCl2, и воду в микроцентрифуге. Храните их при комнатной температуре.
  4. В пробирке объемом 1,5 мл при комнатной температуре приготовьте смесь для ПЦР для одной реакции объемом 20 мкл, добавив следующие компоненты в порядке, указанном ниже:
    1. 10 мкл ферментативной смеси с ДНК-связывающим красителем;
    2. 2 мкл 25 мМ MgCl2;
    3. 1 мкл праймера 1, 6 мкМ (конечная концентрация: 300 нМ);
    4. 1 мкл праймера 2,6 мкМ (конечная концентрация: 300 нМ); и
    5. 5 мкл воды.<бр/> заметка: Чтобы приготовить смесь для ПЦР для более чем одной реакции, умножьте указанные выше объемы на количество реакций, которые необходимо провести, плюс одна дополнительная реакция.
  5. Тщательно перемешайте вортексом.
  6. Пипетка 19 мкл ПЦР-смеси, приготовленной выше, в каждую лунку белого многолуночного планшета.
  7. Добавьте 1 мкл матрицы ДНК с поправкой на концентрацию.
    заметка: Для контрольных реакций всегда проводите отрицательный контроль с образцами. Чтобы подготовить отрицательный контроль, замените матрицу ДНК водой.
  8. Запечатайте белую многолуночную пластину герметизирующей пленкой.
  9. Поместите белую многолуночную пластину в центрифугу и уравновесьте ее подходящим противовесом (т. е. другой многолуночной пластиной). Центрифуга в течение 1 минуты при давлении 1 500 x g в стандартной центрифуге с поворотным ведром, содержащей ротор для многолуночных планшетов с подходящими адаптерами.
  10. Загрузите белый планшет Multiwell в прибор HRM-PCR.
  11. Начните программу HRM-PCR со следующими условиями ПЦР:
    Денатурация: 95 °C в течение 10 мин; 1 цикл.<бр /> Усиление: 95 °C в течение 10 с, 62 °C в течение 15 с и 72 °C в течение 20 с; 47 цикл.<бр /> Кривая плавления: 95 °C; скорость нарастания: 0,02 °С/с; 25 захватов на °C; 1 цикл.<бр /> Охлаждение: 40 °C в течение 30 с; скорость нарастания 2,2 °С/с; 1 цикл.

figure-protocol-1

Таблица 1: Грунтовки и параметры, используемые при анализе плавления с высоким разрешением.

2. Анализ HRM для определения полиморфизма длины CR1

ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная методология (Рисунок 1) специфична для нашего программного обеспечения (см. Таблицу материалов), хотя могут использоваться и другие пакеты программного обеспечения.

  1. Откройте программное обеспечение для сканирования генов, чтобы выполнить анализ сканирования полиморфизма длины CR1.
  2. Откройте эксперимент, содержащий программу амплификации и программу кривой плавления.
  3. Нажмите «Редактор образцов» на панели модулей, а затем выберите рабочий процесс сканирования.
  4. Определите свойства образцов (т. е. название; неизвестный или отрицательный контроль).
  5. Нажмите кнопку Анализ на панели модулей.
  6. В списке Создать новый анализ выберите Сканирование генов.
  7. Перейдите на вкладку Нормализация, чтобы нормализовать кривые плавления.
  8. Перейдите на вкладку Температурный сдвиг, чтобы сбросить температурную ось (ось x) кривых плавления.
    заметка: На нижнем графике показаны кривые плавления, которые нормализованы и смещены по температуре.
  9. Нажмите кнопку Рассчитать, чтобы проанализировать результаты и определить группировку.
  10. Перейдите на вкладку График разницы в области диаграмм, чтобы просмотреть Нормализованные и смещенные кривые плавления, а также График нормализованной и смещенной разницы температур
    11. .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Скриншоты графического интерфейса программного обеспечения, используемого на шаге 2 протокола. (A) Откройте программное обеспечение для сканирования генов. (B) Программа амплификации и программа кривой плавления. (C) Нажмите на Редактор образцов на панели модулей. (D) Выберите Сканирование. (E)

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Халатезащита
SensiCareIce неопудренные нитриловые смотровые перчаткиMedline Industries, Inc, Манделейн, Иллинойс 60060, США486802Защита образцов
Дозатор Eppendorf Reference 2, 0,5-10 μлEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция4920000024Пипетирование проб
Eppendorf Reference 2 дозатор, 20-100 μлEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция4920000059Пипетирование проб
Eppendorf Reference 2 дозатор, 100-1000μлEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция4920000083Пипетирование проб
TipOne 10μL Graded, наконечник с фильтромStarlab GmbH, D-22926 Аренбург, ГерманияС1121-3810Пипетирование проб
TipOne 1-100μL скошенный, наконечник фильтра Starlab GmbH, D-22926 Аренбург, ГерманияС1120-1840Пипетирование проб
ART 1000E Барьерный наконечникThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция2079ЭПипетирование проб
Пробирки Eppendorf Safe-Lock, 1,5 мл, качество EppendorfEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция30120086смешивать
Вихревой джинн 2Scientific Industries, Inc, Богемия, Нью-Йорк 111716, СШАСИ-0236смешивать
Центрифуга Mikro 200Hettich Zentrifugen, D-78532, Германия0002020-02-00центрифугирование
Мультипетт E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, Франция4987000010распределение
Light Cycler 480 многолуночная пластина 96, белыйRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Мангейм, Германия4729692001место реакции
Light Cycler 480 уплотнительная пленкаRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Мангейм, Германия4429757001охват
LightCycler 480 Instrument II, 96-луночныйRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Мангейм, Германия05015278001Полимеразная цепная реакция плавления с высоким разрешением
Центрифуга Heraeus Megafuge 11RThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, Франция75004412центрифугирование
LightCycler 480 Мастер плавления с высоким разрешениемRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Мангейм, Германия04909631001реакционные реагенты
Грунтовка CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Подразделение Eurogentec Biologics, B4102 Seraing, Бельгияреакционный реагент
Грунтовка CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Подразделение Eurogentec Biologics, B4102 Seraing, Бельгияреакционные реагенты
Программное обеспечение для осветительных амплификаторов 480 SW 1.5.1Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Мангейм, Германияпрограммное обеспечение, используемое для анализа данных полиморфизма HRM-PCR CR1

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CR1

Похожие статьи