Мультиплексная капельная полимеразная цепная реакция для обнаружения метилирования ДНК в лейкоцитах

Аннотация

Источник: Malic, L., et al. Метилирование специфической мультиплексной капельной ПЦР с использованием устройства для генерации полимерных капель для гематологической диагностики.J. Vis. Exp. (2020)

Это видео демонстрирует метод мультиплексной капельной полимеразной цепной реакции для одновременной количественной оценки метилированных участков ДНК в различных популяциях белых кровяных клеток в качестве раннего биомаркера для клинической диагностики и прогноза.

Протокол

1. Генерация капель и ПЦР

ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 представлена информация о прямых и обратных праймерах, а также о зондах двойного гашения гидролиза для генов C-LESS, CD3Z и Foxp3, которые необходимы для мультиплексной амплификации деметилированных генов-мишеней.

1. Приготовьте мастер-микс, как описано в таблице 2.
2. Разморозьте все компоненты мастер-смеси, кроме ферментной смеси. Тщательно перемешайте основную смесь с помощью пипетирования вверх-вниз и кратковременно открутите вниз.
3. Добавьте соответствующий объем (1 μл) бисульфит-преобразованной ДНК в мастер-смесь в ПЦР-пробирке. Перемешайте реакцию пипетированием вверх-вниз и немного открутите вниз.
4. Подсоедините одноразовые трубки для жидкости (внутренний диаметр 0,25 мм, внешний диаметр 1,6 мм) к двум прецизионным стеклянным шприцам (объемом 250 μл) с помощью фитингов PEEK.
5. Предварительно наполните один прецизионный стеклянный шприц 250 μл базового масла, содержащего 5% фторсодержащего поверхностно-активного вещества.
6. Перед загрузкой 100 мкл смеси для ПЦР предварительно заполните еще один прецизионный стеклянный шприц 50 μл масла-носителя, чтобы обеспечить дозирование всего объема образца во время эмульгирования.
7. Установите капельное микрофлюидное устройство на столик вертикального светового микроскопа, оснащенного высокоскоростной камерой, чтобы наблюдать и записывать образование капель в режиме реального времени.
8. Поместите предварительно заполненные шприцы на программируемый шприцевой насос и с помощью соединения PEEK с фитингами (см. Таблицу материалов) подсоедините трубки шприцев к трубкам соответствующих входных каналов капельного микрофлюидного устройства.
9. Поместите трубку от выходного отверстия капельного генератора внутрь ПЦР-пробирки объемом 0,5 мл.
10. Отрегулируйте расход шприцевого насоса до 2 μл/мин и дайте стабилизировать размер капель перед сбором полученной эмульсии.
11. Соберите эмульсию и перенесите 75 мкл в ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл для термоциклирования.
12. Убедитесь, что содержание масла в ПЦР-пробирке точно соответствует объему диспергированной фазы, чтобы предотвратить коалесценцию капель во время термоциклирования.
13. Поместите ПЦР-пробирку объемом 0,2 мл в термоамплификатор и выполните протокол циклирования следующим образом: предварительный нагрев при 95 °C в течение 5 минут, затем 45 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 с и отжиг/растяжение при 60 °C в течение 30 секунд.

Таблица 1: Конструкция грунтовки и гидролизного зонда.

FOXP3 Форвард	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
Реверс FOXP3	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z Форвард	ГГА ТГГ ТТГ ТГГ ТГА ТГА ААА ГТГ
Реверс CD3Z	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS Forward	TTG TAT GTA TGT GAG TGT GGG AGA GA
C-LESS Реверс	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C C
Зонд FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Зонд CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Зонд C-less	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Таблица 2: Основной рецепт смеси для мдПЦР.

реагент	Складское решение	Громкость мастер-микса	Рабочая концентрация
Трис-HCl	1 М	2 мкл	20 мМ
KCl	1 М	10 μл	100 мМ
MgCl2	25 мМ	16 μл	4 мМ
Грунтовки C-LESS	10 μМ	10 μл	1 мкМ каждый
Грунтовки CD3Z	10 μМ	10 μл	1 мкМ каждый
Грунтовки FOXP3	10 μМ	10 μл	1 мкМ каждый
Зонд C-LESS	10 μМ	5 μл	500 нм
Зонд CD3Z	10 μМ	5 μл	500 нм
Зонд FOXP3	10 μМ	5 μл	500 нм
ДНК-полимераза HotStarTaq	5 шт./мкл	8 μл	0,4 единиц/μл
Мишень для ДНК, обработанная бисульфитом	переменная	переменная	переменная
Вода без нуклеазы		переменная
Общий объем		100 мкл

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
ПЦР-пробирка	Bio-Rad, Миссиссога, Онтарио.	TFI0201
Фторповерхностно-активное вещество	RAN Biotechnologies, Беверли, Массачусетс	008-Фторсодержащее поверхностно-активное вещество
Одноразовые трубки для жидкости	доломит	3200063
Одноразовые трубки для жидкости	доломит	3200302
Фитинги PEEK	IDEX Health & Science, Оук-Харбор, штат Вашингтон	-881
Масло-носитель	3M, Сент-Пол, Миннесота
Вертикальный световой микроскоп	Nikon, Мелвилл, Нью-Йорк