$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Контроль качества геномной ДНК
ПРИМЕЧАНИЕ: Геномная ДНК (гДНК) была выделена из периферической крови с использованием хорошо зарекомендовавшего себя метода очистки ДНК на основе кремнеземных мембран. Перед приведенными ниже процедурами концентрация гДНК определялась с помощью спектрофотометра.
- Приготовьте образец гДНК в концентрации 10-100 нг/мкл.
- Добавьте 10 мкл буфера для образцов ДНК в полоску из 8 пробирок.
- Добавьте в пробирки 1 μL DNA ladder или gDNA. Перемешайте смесь в течение 1 минуты с помощью насадки для микропланшетов.
- Загрузите трубку, гелевое устройство и наконечники для пипетки в прибор для электрофореза (Таблица материалов) и начните прогон, нажав кнопку «Пуск».
заметка: Система электрофореза будет работать автоматически одним нажатием на кнопку «Пуск».
- Убедитесь, что нижний маркер, содержащийся в буфере для образца ДНК, правильно назначен на электроферограммах. Если он назначен неправильно, вручную назначьте маркер в «Режиме электрогерограммы» программного обеспечения.
заметка: Число целостности ДНК (DIN) будет рассчитано автоматически. Значение DIN зависит от целостности ДНК. Высокие и низкие значения DIN указывают на высокую интактность и сильно деградированную гДНК соответственно.
- Укажите область размера гДНК (> 200.н.) в «Режиме региона» программного обеспечения для автоматического расчета концентрации гДНК (> 200.н.).
2. Проектирование грунтовки и щупа
- Рассчитайте значения температуры плавления (Tm) с помощью любого открытого инструмента при следующих условиях: 10-25 оснований, 50 мМ Na+/K+, 0,80 мМ dNTP и 3 мМ Mg2+ (Таблица материалов). Разработать прямой и обратный праймеры для амплификации геномной области, содержащей аллели-мишени, со значением Tm около 60 °C и длиной ампликона 100-300.н.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация олигонуклеотидов приведена в таблице 1.
- Проектируйте зонды заблокированных нуклеиновых кислот (LNA) для референтных и вариантных аллелей на основе следующих условий: (i) в каждом зонде присутствуют 1-6 LNA; (ii) флуоресцентный краситель и гаситель присутствуют на 5'- и 3'-концах каждого зонда, соответственно; iii) разница между значениями Tm согласованных и несовпадающих зондов составляет > 10°С; (iv) Значения Tm согласованных и несовпадающих зондов выше и ниже, чем у праймеров, соответственно [например, прямой праймер: 60,8 °C, обратный праймер: 59,8 °C, эталонный аллельный зонд (согласованный/несовпадающий): 62,6/45,3 °C, вариантный аллельный зонд (согласованный/несовпадающий): 61,7/50,5 °C]. Значения Tm были рассчитаны с помощью инструмента открытого доступа, также используемого для шага 2.1.
- Убедитесь, что разработанные праймеры и зонды не охватывают однонуклеотидные полиморфизмы с частотой > 0,1%, как определено по базам данных [например, база данных однонуклеотидных полиморфизмов (dbSNP)].
3. Цифровая ПЦР
- Приготовьте праймеры, зонды и стоковые растворы гДНК в концентрациях, описанных в таблице 1, с помощью TE-буфера и храните их при температуре -20–4 °C.
- Смешайте реагенты при комнатной температуре в общем объеме 15 мкл до конечной концентрации, как описано в таблице 1.
- Добавьте 3 мкл дистиллированной воды вместо гДНК в контроле без матрицы (NTC).
- Приготовьте в 3,5 раза больше ПЦР-смеси в трех экземплярах, чтобы учесть ошибку пипетирования.
- Пипетируйте смесь ПЦР вверх и вниз, чтобы перемешать ее.
- Установите загрузочную платформу на чипы, встроенные в 8-трубную полосу, и установите их на автозагрузчик. Убедитесь, что между чипом и загрузочной платформой есть контакт
.
- Установите загрузочный слайдер на платформу и удерживайте слайдер со стопором погрузчика.
- Пипетируйте 15 мкл ПЦР-смеси на платформе возле кончика ползунка (рис. 1A).
- Запустите загрузчик, нажав кнопку загрузчика (примерно на 1 мин).
заметка: Не проблема, если на платформе останется небольшое количество ПЦР-смеси. Есть возможность последовательного перезапуска загрузчика.
- Установите чип в пробирке, заполненный смесью ПЦР, в боковой слот усилителя герметизации. Нажмите на задвижную крышку и край верхней крышки, чтобы не сломать скол (рисунок 1B).
- Запустите усилитель герметизации (примерно 2 минуты). Последовательно запустите усилитель герметизации в течение 1 минуты, если лужа жидкости все еще видна, потому что неполная герметизация вызывает перекрестное загрязнение положительных сигналов (Рисунки 1C и 1D).
- Добавьте в пробирки 230 μл уплотнительной жидкости, реагента на масляной основе.
заметка: Теперь стружка должна быть погружена в жидкость.
- Установите трубки в термоамплификатор. Запустите термоамплификатор, как описано в таблице 2 (примерно на 2 часа). Настройте температуру или продолжительность ПЦР, если наблюдается неравномерное распределение положительных секций (рисунок 1E).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установить скорость нарастания на уровне около 1 °C/с.
- Оставьте трубки в термоамплификаторе не менее чем на 15 минут, чтобы снизить исходный уровень шума.
заметка: Трубки также можно оставить на ночь. Сигналы флуоресценции были обнаружены даже на следующий день.
- Установите трубки на кондуктор обнаружения и налейте в кондуктор 6 мл дистиллированной воды. Если внутри и снаружи трубок видны пузырьки воздуха, очистите их (рисунки 1F и 1G).
- Загрузите приспособление в детектор и запустите его, нажав на кнопку «Выполнить» программного обеспечения после выбора вкладок «Флуоресценция», «Эксперимент» и «Образец/NTC (Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Двухцветное детектирование восьми образцов со стандартной интенсивностью занимает примерно 4-5 минут.
- Подтвердите график положения, гистограмму и 2D-диаграмму рассеяния.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если интенсивность флуоресценции отрицательных разделов высока, отрегулируйте интенсивность нажатием кнопки «Настройки» программы так, чтобы она находилась в диапазоне 30–70.
- Рассчитайте фракцию вариантного аллеля (VAF) по следующей формуле:
Здесь Cv и Cr — это номера копий варианта и референсного аллеля соответственно.
заметка: Они автоматически рассчитываются в программе на основе статистики Пуассона.
4. Сбор ПЦР-продукта
- Удалите уплотнительную жидкость из трубки.
- Добавьте в пробирку 100 μл TE буфера. Энергично перебейте пробирку в течение 30 с и кратковременно центрифугируйте пробирку.
- Переложите раствор TE в другую пробирку и добавьте 30 μл 3 М ацетата натрия и 200 μл этанола.
- Остудите раствор до -20 °C в течение ночи.
- Центрифугируйте раствор в течение 30 минут при давлении 16 000 x g и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте в пробирку 300 мкл 80% этанола и заворкнись.
- Центрифугируйте раствор в течение 15 мин при давлении 16 000 x g и удалите надосадочную жидкость. Дайте осадку высохнуть на воздухе в течение 5 минут.
- Растворите осадок в 1–5 μл TE-буфера после сушки на воздухе.
- При необходимости оцените размер изделия с помощью прибора для электрофореза со ссылкой на шаг 1. Загрузите 1 мкл раствора в гелевое устройство для получения высокой чувствительности (Таблица материалов).
