$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры с участием людей были выполнены в соответствии с институциональными, национальными и международными рекомендациями по благополучию человека и были рассмотрены местным институциональным наблюдательным советом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура специально разработана для обнаружения небольшого количества молекул кДНК в свежезамороженных тканях человека. Срезы тканей были разрезаны на сухом льду, пока они еще заморожены, из ранее проверенных образцов опухоли желудка, полученной от пациента, или нормальных тканей.
1. Выделение и очистка РНК
- Экстракция РНК
заметка: Выделение РНК выполняется под капотом с помощью определенного продукта (см. Таблицу материалов). Тем не менее, в продаже имеются различные изоляционные комплекты.
- Гомогенизируйте 50 - 100 мг мелко нарезанного свежезамороженного образца ткани в пробирке объемом 1,5 мл с 1 мл реагента для выделения РНК и энергично перебейте в течение 15 с. Инкубируйте пробирки при -80 °C в течение ночи.
- Инкубировать пробирку с образцом при комнатной температуре в течение 5 минут и перемешивать путем вортексирования в течение 15 с.
- Держите трубку на льду, добавьте 200 μл хлороформа и энергично ворксируйте в течение 15 с.
- Пробирки инкубировать при комнатной температуре в течение 60 с и центрифугировать их при 12 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
- Перенесите водную фазу в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 20 μг гликогена.
заметка: Важно тщательно избегать переноса каких-либо межфазных или органических слоев, чтобы уменьшить загрязнение.
- Добавьте 500 μL изопропанола, перевернув пробирку для перемешивания, и выдерживайте на льду в течение 10 минут.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 12 000 x g в течение 15 мин при 4 °C для осаждения РНК.
заметка: РНК будет присутствовать в гелеобразной грануле сбоку и на дне пробирки, часто невидимой после центрифугирования.
- Удалите надосадочную жидкость, не нарушая осадок, и промойте ее 1 мл 75% этанола путем пипетирования.
- Центрифугируйте пробирку при давлении 7 500 x g в течение 5 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость, не повреждая гранулу.
- Дайте грануле высохнуть, пока осадок не станет прозрачным, и растворите его в 50 мкл воды, не содержащей РНКазы.
- Перед количественным определением образцы заморозьте при температуре -80 °C не менее чем на ночь.
- Элиминация геномной ДНК и выделение РНК
заметка: Этап расщепления ДНКазы с последующей очисткой РНК на основе столбцов рекомендуется для анализа мишеней с низким содержанием с целью расщепления загрязняющей ДНК.
- Растворите лиофилизированную ДНКазу I (1500 единиц Куница) в 550 мкл воды, не содержащей РНКазы, с помощью шприца, аккуратно перемешайте, перевернув флакон, и разделите восстановленный исходный раствор на аликвоты.
- Перенесите в пробирку объемом 1,5 мл рассчитанный объем образца с 15 мкг РНК, 10 мкл буфера для разложения ДНКазы из набора (приведен в таблице материалов), 2,5 мкл стокового раствора ДНКазы I и воды, не содержащей РНКазы, до 100 мкл. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавьте 350 мкл буфера для лизиса тканей (из набора, см. Таблицу материалов) и перемешайте с помощью пипетирования.
- Добавьте 250 μл 100% этанола и перемешайте с помощью пипетирования.
- Перенесите весь объем (700 μл) в новую спиновую колонку и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 15 с.
- Переложите фильтр в новую сборную трубку, добавьте в колонку 500 μл 80% этанола и центрифугируйте при 12 000 x g в течение 2 минут.
- Откройте крышку спиновой колонны и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 5 минут с помощью новой сборной пробирки, чтобы высушить фильтр, затем переложите фильтр в пробирку объемом 1,5 мл.
- Добавьте 14 мкл воды, не содержащей РНКазы, непосредственно в фильтрующую колонну и центрифугируйте при давлении 12 000 x g в течение 1 минуты.
- Держите образцы на льду и приступайте к количественному определению, используя 2 мкл образца на настольном спектрофотометре или храните РНК при температуре -80 °C до использования.
2. Настройка цифровой ПЦР-реакции
- Реакционная смесь для дПЦР и подготовка образцов
- Разморозьте исходную смесь и пробу при комнатной температуре не менее 20 минут.
- Разбавьте образцы кДНК до концентрации 300 нг в 6 мкл воды.
- Аккуратно смешайте исходную смесь и приготовьте смесь в стерильной пробирке с 8,7 мкл исходной смеси, 0,87 мкл специально разработанного праймера для анализа CDH1a и 1,83 мкл воды, не содержащей нуклеаз, чтобы получить окончательный объем 11,4 μл<бр/>
заметка: Подробную информацию о специально разработанном праймере для анализа CDH1a см. в Таблице материалов.
- Переложите 11,4 мкл приготовленной смеси в разведенный образец кДНК, аккуратно перемешайте и кратковременно центрифугируйте.
заметка: Объемы включают в себя 20% превышения, чтобы компенсировать потерю объема при пипетировании. Подготовьте смесь для всех образцов и без шаблонного контроля (NTC).
- Подготовка стружки
Примечание: Для достижения оптимальных результатов загрузите чипы как можно скорее.
- Подключите загрузчик стружки и подождите, пока индикатор не загорится зеленым цветом.
- Снимите колпачок шприца с иммерсионной жидкостью, осторожно оттянув поршень на 1 - 2 мм и отпустив его, чтобы облегчить этот шаг, и замените его наконечником.
- Возьмите новый чип и запишите код, написанный на крышке, чтобы связать его с образцом.
- Осторожно держите крышку рядом с ней, снимите защитную пленку и поместите крышку липкой лицевой стороной вверх в правильную ориентацию.
- Осторожно возьмите стружку, стараясь не задеть внутреннюю часть, и загрузите ее в гнездо для стружки в правильном положении, нажав на рычаг, чтобы открыть зажим.
- Загрузите новое погрузочное лезвие на погрузчик и осторожно нажмите на него, чтобы убедиться, что оно надежно установлено на месте.
- Перенесите 14,5 мкл реакционной смеси dPCR на загрузочное лезвие, не образуя пузырьков воздуха и не отклоняя лезвие, после чего нажмите черную кнопку загрузки, чтобы распределить объем на чипе.
- С помощью шприца с иммерсионной жидкостью нанесите около 20 капель на поверхность скола, стараясь не касаться поверхности наконечником.
заметка: Важно покрыть всю поверхность, не проливая жидкость по краям.
- Поверните рычаг загрузчика, чтобы крышка соприкоснулась со стружкой, и нажмите на нее в течение 15 с.
- Нажмите кнопку крышки, чтобы освободить чип и вернуть рычаг в исходное положение.
- Держите собранный чип под углом 45° и осторожно выдавите погружную жидкость из шприца через заливное отверстие, слегка поверните чип, чтобы убедиться в отсутствии пузырьков воздуха, и удалите лишнюю жидкость стерильной салфеткой.
- Закройте корпус чипса, аккуратно сняв этикетку с верхней части крышки чипса, и нажмите на заливное отверстие не менее чем на 5 секунд.
- Храните чип в темноте до готовности к загрузке в термоамплификатор.
заметка: Подготовленную стружку следует использовать в течение 2 ч.
- реакция дПЦР
- Откройте крышку и установите адаптеры на оба блока, даже если используется один блок.
- Поместите стружку на блок образца в правильном положении.
заметка: Заливное отверстие должно быть ориентировано по направлению к передней части термоамплификатора в приподнятом положении, чтобы пузырьки воздуха могли подниматься наверх, не нарушая окно чипа. Используйте пустые фишки, чтобы сбалансировать два блока.
- Положите термопрокладку на блок образца, чтобы полностью покрыть стружку.
- Закройте крышку и начните ПЦР-прогон, соблюдая следующие условия: держать при температуре 96 °C в течение 10 минут; 45 циклов при температуре 60 °C в течение 2 минут и при 98 °C в течение 30 секунд; держать при температуре 60 °C в течение 2 минут; держать при температуре 4 °C. Выключите термоамплификатор и разморозьте чипсы при комнатной температуре не менее 10 минут<бр/>
заметка: Анализ чипа должен быть выполнен в течение одного часа.
- Анализ стружки
- Откройте крышку прибора и снимите термопрокладки, затем удалите стружку из адаптеров.
заметка: Храните чипсы в темном, чистом месте до анализа.
- Очистите поверхность скола изопропанолом и стерильной салфеткой.
заметка: Осмотрите каждую микросхему на наличие утечек или потенциальных проблем.
- Вставьте USB-накопитель в систему детектора, чтобы сохранить данные.
- Откройте лоток для чипов детекторной системы, загрузите чип лицевой стороной вверх в правильное положение, а затем закройте лоток.
- Подождите 30 с для обработки, затем удалите чип и вставьте следующий.
- Дождитесь завершения анализа всех обработанных микросхем, затем вставьте USB-накопитель в компьютер для передачи файлов.
заметка: Общее время анализа составляет от 2 до 3 минут на чип.
3. Анализ и интерпретация данных
- Подключитесь к облачной программной платформе, необходимой для выполнения всех последующих анализов.
- Создайте проект и импортируйте все файлы данных интересующих чипов.
- Введите название образца, выберите используемый краситель и пробу на вкладке «Определить чипы».
- Определите, является ли чип приемлемым, визуализировав его во вкладке «Просмотр данных», проверив, насколько тщательно образец был загружен в чип и сколько точек данных являются ценными.
заметка: Отбраковывайте чипы с менее чем 13 000 оцениваемых точек данных.
- Перейдите к диаграмме рассеяния выбранной микросхемы в правой части экрана; примените пороговое значение 6000 для сигналов репортерного красителя флуоресцеина амидита (FAM) (ось Y) ко всем микросхемам><.
заметка: Установка порога может варьироваться в зависимости от используемых анализов.
- Удалите все сомнительные положительные сигналы, чтобы предотвратить ложные срабатывания, выбрав относительное пятно на диаграмме рассеяния с помощью инструмента лассо и нажав на «неопределенное». Все остальные положительные пятна указывают на наличие копий кДНК анализируемой редкой мишени.