Методическая статья

Дот-блоттинг для количественной оценки вирусного генома

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Powers, J. M. et al., Количественный анализ Dot Blot для титрования AAV и его использование для функциональной оценки белков, активирующих сборку аденоассоциированного вируса.J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы описываем анализ точечной блоттинга для количественной оценки вирусного генома. Интенсивность сигнала напрямую связана с количеством вирусной ДНК в образце.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты растворов и буферов, необходимых для этого протокола, представлены в таблице 1.

1. Точечный блот

  1. Подготовка стандартов плазмидной ДНК
    1. Разбавьте плазмидную ДНК векторного генома AAV до 10 нг/мкл в воде или буфере Tris-HCl (10 мМ, pH 8,0). Возьмите 25 мкл этого разбавления и расщепите с соответствующим ферментом рестрикции в течение 1 ч для линеаризации плазмидной ДНК в реакционном объеме 50 мкл<бр/> заметка: Делаем дубликат сета дижестива (см. шаг 1.4.1). Подходящим ферментом должен быть фермент, который разрезает плазмидную ДНК за пределами обла....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
БензоназаМиллипорСигма1016970001В основном тексте упоминается как эндонуклеаза Serratia marcescen.
ДНКаза IРош4716728001В основном тексте упоминается как DNase I Enzyme A.
ДНКаза IИнвитроген18047019В основном тексте обозначается как ДНКаза I Энзим В.
ДНКаза IБиолаборатории Новой АнглииМ0303ЛВ основном тексте упоминается как DNase I Enzyme C.
1,5 мл Прилагаемые пробирки для микроцентрифуг с завинчивающейся крышкой с уплотнительным кольцомКорнинг430909
Полипропиленовая коническая трубка 15 млКорнинг352097
3 м ацетата натрияТекноваС0298
Полипропиленовая коническая трубка 50 млКорнинг430291
Решение AccuGENE 0,5 М ЭДТАЛонза51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0ЛонзаNo 51238
AccuGENE 10% SDSЛонза51213
Буфер AccuGENE 1X TEЛонзаNo 51235
Аппарат Bio-DotБио-Рад1706545
Бычий сывороточный альбуминМиллипорСигмаА3294
Клеточный лифтерКорнинг3008
хлороформМиллипорСигма372978
Набор для экстрактора ДНКВако Пьюпер Кемикал Индастриз295-50201 (АнглийскийОн используется для количественного точечного блоттинга на очищенном вирусе. На каждом этапе мы используем только половину объема всех реагентов, рекомендованных для Схемы протокола 2 в инструкции, предоставленной производителем.
Этанол 200 крепостьЛаборатории Decon2716
Фиколл 400Альфа АэсарВ22095Упоминается как полисукроза 400.
гликогенРош10901393001
ДНК спермы сельдиИнвитроген15634-017
Гибридизационные трубкиThermo Fisher ScientificТел.: 13-247-150
ImageQuant TLGE Здравоохранение Медико-биологические наукиImageQuant TL
Гексагидрат холорада магнияМиллипорСигмаМ0250
Кассета для рентгенографииGE Здравоохранение Медико-биологические наукиразличный
Экран для фосфорной визуализацииGE Здравоохранение Медико-биологические наукиразличный
Набор Plasmid MaxiЦИАГЕНNo 12162
ПолиэтилениминПолинаука Инк23966-2
ПоливинилпирролидонМиллипорСигмаП5288
Раствор протеиназы КИнвитроген25530-049 (Английский)
Ферменты рестрикцииБиолаборатории Новой Англииразличный
ДНК спермы лососяИнвитроген15632011
Серологические пипеткиThermo Fisher Scientific13-678-11Д / 13-678-11Е / 13-678-11
Хлорид натрияThermo Fisher ScientificС271-10
Цитрат натрия трехосновной дигидратМиллипорСигмаС8532
База ТрисThermo Fisher ScientificБП152-5
Тайфун FLA 7000GE Здравоохранение Медико-биологические науки28955809
Ультрачистый фенол, насыщенный буферомИнвитроген15513-047
УФ-сшивательСпектролайнXLE-1000Используется оптимальный режим Crosslink, обеспечивающий дозировку УФ-энергии 120 мДж/см2.
Дзета-зондовая мембранаБио-Рад162-0165 (Английский
г. ) г. )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи