Дот-блоттинг для количественной оценки вирусного генома

ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепты растворов и буферов, необходимых для этого протокола, представлены в таблице 1.

1. Точечный блот

1. Подготовка стандартов плазмидной ДНК
   1. Разбавьте плазмидную ДНК векторного генома AAV до 10 нг/мкл в воде или буфере Tris-HCl (10 мМ, pH 8,0). Возьмите 25 мкл этого разбавления и расщепите с соответствующим ферментом рестрикции в течение 1 ч для линеаризации плазмидной ДНК в реакционном объеме 50 мкл<бр/> заметка: Делаем дубликат сета дижестива (см. шаг 1.4.1). Подходящим ферментом должен быть фермент, который разрезает плазмидную ДНК за пределами области связывания зонда dot blot. Для удобства разбавленную плазмидную ДНК можно аликвотировать (25 μл/пробирку) и хранить в замороженном виде при температуре -20 °C для дальнейшего использования. Расщепите плазмидную ДНК во время тряски трубок на шаге 5.1. Не переваривайте стандарт плазмидной ДНК.
   2. Добавьте 450 μL воды или TE в пробирку, содержащую стандарт расщепленной плазмиды ДНК, и тщательно перемешайте. Перелейте 70 мкл этой смеси в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с 1 330 мкл воды или TE, чтобы получить стандарт разбавленной плазмиды (25 пг/мкл).
   3. В таблице 1 приведен набор двукратных последовательных разведений (600 мкл/тюбик). Тщательно перемешайте разведения, вортексируя в течение 5 с.
2. Денатурация стандартов и образцов вирусной ДНК
   1. Добавляйте 600 μл 2x щелочного раствора в каждое стандартное разведение. Хорошо перемешайте, вортексируя в течение 5-10 секунд. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
   2. Добавьте 120 мкл 2x щелочного раствора в каждый образец вирусной ДНК. Хорошо перемешайте, вортексируя в течение 5-10 секунд. Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
3. Настройка аппарата для блот-блоттинга
   1. С помощью ножниц разрежьте промокательную (например, дзета-зонд) мембрану до размера, соответствующего количеству образцов и стандартам. Смочите мембрану водой на 10 минут, прежде чем поместить ее на аппарат для блот-блота. Закройте неиспользуемые лунки на мембранном аппарате.<бр/> заметка: Обработайте мембрану чистым пинцетом. Для закрытия пустых колодцев можно использовать светло-голубой защитный лист, который идет в комплекте с мембраной. Не допускайте высыхания мембраны до связывания образцов и стандартов. Более подробную информацию о сборке и использовании аппарата можно найти в руководстве пользователя.
   2. Добавьте воду в колодцы, в которые будут загружаться пробы. Примените вакуум и протяните воду через скважины, чтобы проверить наличие ошибок и повторно проверить их после исправления. Снова затяните винты, применяя вакуум, чтобы обеспечить плотную герметизацию.
      заметка: Неполная герметизация может привести к утечке проб между скважинами.
   3. Как только вода полностью протянется, полностью выпустите вакуум (т.е. вакуумный коллектор должен быть открыт для давления воздуха).
4. Загрузка стандартов и образцов в аппарат для дот-блоттинга
   1. Нанесите по 400 мкл каждой стандартной разведенной плазмидной ДНК в каждую лунку и запустите четыре полосы стандартных разведений. Используйте две отдельные аликвоты стандартного дайджеста и загрузите каждую в двух экземплярах. Внесите 200 μл/лунку каждого образца вирусной ДНК.
      заметка: Используя оставшиеся ~40 мкл денатурированных образцов, можно получить разбавленные образцы (например, 10-кратно разбавленные образцы с использованием 20 мкл образца плюс 180 мкл 1x щелочного раствора) и при необходимости промокнуть.
   2. Примените легкий вакуум, чтобы протянуть растворы ДНК через лунку.
      заметка: Давление вакуума необходимо регулировать путем частичного открытия трехходового клапана, чтобы давление вакуума подавалось на аппарат точечной блотации, а также на атмосферу (т.е. с помощью рычагов запорного крана, расположенных под углом примерно 45°, где он издает более громкий шум всасывания).
   3. После того, как все лунки опустошатся, выпустите вакуум, отрегулировав трехходовой клапан. Добавьте 400 мкл 1x щелочного раствора в каждую лунку, содержащую стандарты и образцы. Подождите 5 минут, прежде чем снова подать вакуум для опорожнения лунок.
   4. Снова нанесите вакуум таким же образом.
   5. Разберите аппарат dot blot под вакуумом, снимите мембрану и промойте ее 2x SSC. Поместите мембрану на чистое бумажное полотенце стороной, связанной с ДНК, вверх, чтобы удалить излишки 2x SSC.
   6. УФ-сшивание блотированной ДНК с мембраной с помощью соответствующего УФ-сшивающего агента; мембрана теперь готова к гибридизации><. заметка: Влажные мембраны могут использоваться для УФ-сшивки. Высушенные УФ-сшитые мембраны можно хранить при комнатной температуре. Более подробную информацию можно найти в Таблице материалов.

2. Гибридизация и промывка

1. Нагрейте буфер для гибридизации на водяной бане при температуре 65 °C.
2. Ферментативно пометьте зонд ДНК радиоактивным ^α-32P dCTP и очистите его с помощью имеющихся в продаже наборов в соответствии с рекомендацией производителя.
   заметка: Мы используем зонд длиной 0,5–2,0.н. из области энхансер-промотора или последовательности, кодирующей белки в вирусном геноме. Несмотря на то, что в этом протоколе для обнаружения сигнала используются ³²P-меченых радиоактивных зонда, также можно использовать нерадиоактивные хемилюминесцентные или флуоресцентные зонды (см. раздел «Обсуждение»).
3. Поместите мембрану в бутылку для гибридизации стороной вверх, связанной с ДНК, промойте мембрану 5 мл предварительно подогретого буфера для гибридизации и выбросьте буфер. Затем добавьте 10 мл предварительно подогретого буфера для гибридизации и поместите бутылку во вращающуюся гибридизационную печь, установленную при температуре 65 °C. Вращайте в течение ≥5 минут.
4. Нагрейте 20 мкл раствора ДНК стриженой сельди или спермы лосося с концентрацией 10 мг/мл и зонд с ³²P-метками (≥10⁷ cpm) в течение 5 минут, поместив пробирки на нагревательный блок, установленный при температуре 100 °C. Затем охладите их на льду в течение ≥2 минут, немного покрутите и держите на льду до использования.
   осторожность: Для зондов радиоактивной ДНК необходимо использовать пробирки объемом 1,5 мл с завинчивающимися крышками и уплотнительными кольцами.
5. Быстро добавьте денатурированную ДНК сперматозоида и радиоактивный зонд в буфер для гибридизации в бутылке для гибридизации и встряхивайте бутылку в течение 10 секунд для смешивания. Верните бутылку в духовку при температуре 65 °C и инкубируйте бутылку при вращении при температуре 65 °C в течение ≥4 часа.
6. После завершения гибридизации остановите вращение, извлеките бутылку для гибридизации, а затем налейте раствор радиоактивного зонда в коническую пробирку объемом 50 мл с герметичной заглушкой. ><Храните зонд в соответствующем контейнере, помещенном в холодильник, предназначенный для радиоактивных материалов. заметка: Использованный буфер для гибридизации с зондом, который хранится при температуре 4 °C, может быть повторно использован не менее 5 раз, поместив коническую пробирку объемом 50 мл с герметичной заглушкой, содержащей буфер для гибридизации, в водяную баню при температуре 100 °C на 5 минут.
7. Промойте мембрану буфером для промывки, нагретым до 65 °C. Добавьте от 20 до 30 мл буфера для промывки в бутылку для гибридизации и вращайте в течение 5 минут. Повторите эту промывку еще 2 раза.
   заметка: Измерьте радиоактивность промывочных растворов и запишите ее, если это требуется местным учреждением.
8. Во время промывки мембраны поместите люминофорный экран на ластик изображения на 5 минут.
9. После третьей промывки снимите мембрану с флакона для гибридизации, удалите излишки буфера на мембране бумажными полотенцами и поместите мембрану в прозрачный пластиковый держатель для бумаги. Проверьте радиоактивные сигналы на мембране с помощью счетчика Гейгера. Приложите стертый люминофорный экран к мембране на срок от 10 минут до ночи, в зависимости от интенсивности сигнала.
10. Отсканируйте экран с помощью люминофорной системы сканирования изображения и получите данные об интенсивности сигнала каждой точки.

Таблица 1: Количественные стандарты плазмидной ДНК методом точечного блоттинга. Показаны необходимые объемы стандартного раствора плазмидной ДНК 25 пг/мкл и воды или TE для получения стандартов плазмидной ДНК путем двукратного серийного разведения (600 мкл/тюбик). Цифры в стандартном столбце плазмидной ДНК (от 0,039 до 5 нг) представляют собой количество ДНК в 200 мкл каждого стандартного раствора плазмидной ДНК.