1. Подготовка образцов
- Возьмите 50 мг мышиной ткани в пробирку объемом 1,5 мл. Добавить 200 мкл лизисного буфера (50 мМ HEPES, pH 7,4, 137 мМ NaCl, 5 мМ ЭДТА, 5 мМ EGTA, 1 мМ MgCl2, 10 мМ Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% глицерина), с добавлением ингибиторов протеазы и фосфатазы (100 мМ NaF, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида, 5 мкг/мл пепстатина, 10 мкг/мл лейпептина, 5 мкг/мл апротинина).
- Гомогенизируйте ткань гомогенизатором в течение 1 минуты на льду.
- Центрифугируйте в течение 10 минут при 8 000 x g при 4 °C.
- Соберите надосадочную жидкость в новые пробирки (1,5 мл) и выньте 1 мкл для определения концентрации белка с помощью набора BCA.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все обычно используемые буферы лизиса для анализа вестерн-блоттинга и анализа точечного блоттинга могут быть использованы для анализа QDB.
2. Определение специфичности антител
- Подготовьте образец лизатов (20 мкг) в разделе 1.4, без IgG-БСА (20 мкг) и стандартный белок (600 пг) для вестерн-блоттинга.
ПРИМЕЧАНИЕ: БСА, не содержащий IgG, используется в качестве отрицательного контроля, а стандартный белок используется в качестве положительного контроля. Специфичность антитела демонстрируется путем демонстрации одной полосы нужного размера с помощью вестерн-блоттинга.
3. Определение линейного диапазона анализа QDB
- Растворите стандартный белок с ddH2O. Разбавьте белок до концентрации 1200 пг/мкл.
- Концентрированный белок развести из подготовленных образцов в секции от 1,4 до 4 мкг/мкл.
- Растворите BSA с ddH2O. Разбавьте белок до концентраций 1200 пг/мкл и 4 мкг/мкл.
- Серию разведений стандартного белка и подготовленных образцов готовили под руководством Таблицы 1 и Таблицы 2.
- Смешайте 10 мкл разведенного стандартного белка или приготовленных в разведении образцов и 10 мкл 2x загрузочного буфера (120 мМ Tris-HCl pH 6,8, 20% глицерина, 4% SDS, 0,2% бромфенола синего, 200 мМ DTT).
- Нагрейте смеси при температуре 85 °C в течение 5 минут.
4. Процесс анализа QDB
- Пример приложения
- Опирайтесь на пластину QDB так, чтобы нижняя часть пластины не касалась поверхности стола. Например, используйте пустую коробку для наконечника для пипетки в качестве опоры.
- Загрузите до 2 мкл образца в центр мембраны в нижней части отдельного блока планшета QDB.
- Сушка тарелки
- Оставьте загруженную пластину QDB на 1 час при комнатной температуре (RT) или, в качестве альтернативы, оставьте загруженную пластину при температуре 37 °C на 15 минут в хорошо проветриваемом помещении.
- Блокировка пластины
- Опустите планшет QDB в буфер для переноса (0,039 М глицина, 0,048 М Трис, 0,37% SDS, 20% метилового спирта) и осторожно встряхивайте пластину в течение 10 секунд.
- Аккуратно промойте пластину QDB TBST (Трис-буферизованный физиологический раствор, 0,1% Tween 20) три раза, а затем промойте пластину в течение 5 минут в TBST при постоянном встряхивании.
- Заблокируйте планшет QDB блокирующим буфером (5% обезжиренного молока в TBST (100 мкл/лунка) на 1 ч при постоянном встряхивании.
- Первичная инкубация антител
- Разведите первичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации (от 1:500 до 1:5000) и добавьте по 100 мкл в каждую отдельную лунку обычного 96-луночного планшета. Вставьте планшет QDB в 96-луночный планшет и инкубируйте комбинированные планшеты в течение 2 ч при RT или в течение ночи при 4 °C при постоянном встряхивании.
- В качестве альтернативы поместите планшет QDB внутрь коробки и заполните коробку блокирующим буфером на 2-3 мм выше мембранной части планшета, если для всей пластины используется одно и то же антитело. Добавьте первичное антитело в выбранной концентрации и инкубируйте планшет либо в течение 2 ч при RT, либо в течение ночи при 4 °C при постоянном встряхивании.
- Осторожно промойте тарелку с TBST три раза, прежде чем она будет промыта TBST три раза, каждый раз в течение 5 минут при постоянном встряхивании.
- Вторичная инкубация антител
- Разбавляют вторичное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации (от 1:1000 до 1:50000) и либо аликвоту 100 мкл/лунку в 96-луночный планшет, либо в бокс, как описано в разделе 4.4.2, а затем инкубируют планшет QDB внутри загруженного 96-луночного планшета или бокса в течение 1 ч при RT при постоянном встряхивании.
- Осторожно промойте пластину QDB 3 раза с TBST, затем промойте тарелку 3 раза, по 5 минут каждый с TBST при постоянном встряхивании.
- квантификация
- Приготовьте усиленную хемилюминесцентную подложку (ECL), следуя инструкциям производителя.
- Аликвотируйте подложку ECL в 96-луночный планшет (100 μл/лунка) и вставьте планшет QDB внутрь 96-луночного планшета на 2 минуты при постоянном встряхивании.
- Снимите планшет QDB с 96-луночного планшета и кратковременно встряхните, чтобы удалить лишнюю жидкость. Поместите пластину на белую пластину с микротитрованием.
- Включите считыватель микропланшетов и выберите «пластина с крышкой» в пользовательском интерфейсе, прежде чем помещать комбинированные планшеты (пластина QDB + адаптер белой пластины) внутрь считывателя микропланшетов для количественной оценки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте белую непрозрачную микротитровальную пластину в качестве адаптера, чтобы избежать помех от пластины. Убедитесь, что вы выбрали «пластину с крышкой», чтобы избежать заклинивания машины, когда комбинированные пластины (пластина QDB + адаптер для 96-луночных пластин) размещены внутри считывателя микропланшетов.
Таблица 1. Схема разведения для стандартной белковой кривой.
См.
мм
Сталь
См.
мм
| С1<бр />
(0 пг/мкл) | S2 (33,3 пг/мкл) | С3<бр />
(100 пг/мкл) | С3<бр />
(300 пг/мкл) | С5<бр />
(600 пг/мкл) | S6
(1200 пг/мкл) |
| Стандартный белок (1200 пг/мкл) | 0 | 1.39 | 4.17 | 12,5 | 25 | 50 |
BSA
без IgG
(4 пг/мкл) | 50 | 48.61 | 45.83 | 37,5 | 25 | 0 |
| итог | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Таблица 2. Схема разбавления подготовленных образцов
мм
Тариф
Сталь
мм
| X1
(0μг/μл) | X2
(0,25μг/μл) | X3
(0,5 мкг/мкл) | X4
(1μг/μл) | X5
(2 г/л) | X6
(4 мкг/мкл) |
| Образец (4μг/μл) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12,5 | 25 | 50 |
| BSA без IgG (4 г/мкл) | 50 | 46.875 | 43.75 | 37,5 | 25 | 0 |
| итог | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
