ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был оптимизирован с использованием стандартизированных, коммерчески доступных наборов и реагентов для повышения воспроизводимости (см. Таблицу материалов).
1. Подготовка образцов
- Экстракция белка
- Перенесите замороженные образцы клеток или тканей с температурой -80 °C на сухой лед, разморозьте на льду и промойте по мере необходимости ледяным 1x фосфатно-солевым буфером (PBS). Избегайте ненужных циклов замораживания-размораживания, так как это повлияет на качество белка.
- Добавьте в каждый образец буфер для радиоиммунопреципитации (RIPA) (25 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 1% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS), содержащий 1x ингибитор протеазы, используя оптимальное количество на массу ткани.
заметка: В зависимости от области применения тип и объем буфера гомогенизации могут нуждаться в дальнейшей оптимизации.
- Используйте ручной электрический гомогенизатор с полипропиленовым пестиком для гомогенизации образцов тканей. Между каждым образцом промойте пестик в дважды дистиллированной воде и высушите его чистой салфеткой. Меняйте пестик между различными экспериментальными условиями и тканями.
- Оставьте образцы на льду на 10 минут после гомогенизации. Центрифугируйте образцы при >10 000 x g при 4 °C в течение 10 минут.
- Переложите надосадочную жидкость в новую пробирку на льду, не потревожив гранулу. Надосадочная жидкость — это образец белка. Храните извлеченный белок при температуре -80 °C или сразу приступайте к измерению концентрации белка.
- Количественная оценка и нормализация концентрации белка
- Измерьте концентрацию белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (ВСЦ). Приготовьте смесь для анализа BCA в соответствии с инструкциями производителя в 96-луночном оптическом планшете, используя 200 μL смеси BCA на лунку.
заметка: Другие методы количественной оценки, такие как анализы Лоури и Брэдфорда, также могут быть использованы для определения концентрации белка при условии, что концентрация белка определяется последовательно в разных экспериментах.
- Приготовьте стандарты бычьего сывороточного альбумина (БСА) в возрастающих концентрациях в трех экземплярах и добавьте 1 мкл каждого образца белка в двух экземплярах. Инкубируйте 96-луночный планшет в предварительно нагретом тепловом блоке при температуре 60 °C в течение 10 минут или дольше, если ожидается, что концентрация белка будет низкой.
- После инкубации измерьте абсорбцию на длине волны 560 нм с помощью планшетного ридера.
- Экспортируйте измерения считывателя планшетов и рассчитайте концентрацию белка путем сравнения средних значений поглощения каждого образца со стандартной кривой, полученной с использованием стандарта белка. Значение R-квадрат для стандартной кривой должно быть больше или равно 0,98 для точной оценки концентрации белка в образце.
- Нормализовать количество белка можно путем приготовления разведений образцов белка в образце буфера и сверхчистой воды. Общий объем можно регулировать в зависимости от типа используемого геля. Рекомендуется загружать 30 г белка на дорожку в качестве начального количества. При необходимости добавьте восстановитель, такой как дитиотреитол (DTT; конечная концентрация 5 мМ) или бета-меркаптоэтанол (конечная концентрация 200 мМ). Пипетка неразбавленного бета-меркаптоэтанола в вытяжном шкафу.
- Инкубируйте образцы в тепловом блоке при температуре 70 °C в течение 10 мин. Поместите образцы на лед, вихрь и кратковременно замедлите вращение для сбора. Держите на льду до загрузки геля.
2. Гель-электрофорез образцов белка
- Настройка устройства и геля
- Установите сборный 4–12% градиентный гель Bis-Tris (см. Таблицу материалов) в камеру для гелевого электрофореза. Перед использованием промойте гели водой двойной дистилляции.<бр />
Примечание: В зависимости от размера, взаимодействий и распространенности интересующего белка можно использовать гели с различным градиентом, буферным агентом или размером и количеством лунок.
- Добавьте 500 мл 1x MES SDS бегового буфера, разведенного в воде двойной дистилляции, на каждый бак. Осторожно снимите гребень с гелей после добавления рабочего буфера, не нарушая углубления в стекляющем геле.
- Белковая нагрузка
- Загрузите в лунку 3,5 мкл белка стандарта. В зависимости от расположения образца, загрузка белковой лестницы с обеих сторон геля может помочь более точно оценить размер белка. Используйте наконечники для загрузки геля с тонкими наконечниками для более точной загрузки образцов.
- При использовании внутреннего стандарта для нормализации между мембранами (см. шаг 5 ниже и обсуждение) загрузите количество, равное другим образцам, в первые 3 лунки рядом с белковой лестницей.
- Загрузите по 30 мкг каждой пробы в оставшиеся лунки. Добавьте 1x буфер для проб во все пустые лунки.
- электрофорез
- Соберите бак с гелем после загрузки образцов. Пропустите образцы через укладывающий гель при напряжении 80 В в течение 10 минут, а затем при напряжении 150 В в течение дополнительных 45-60 минут.
3. Перенос белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос белка в этом протоколе выполняется с использованием коммерчески доступной полусухой блоттинговой системы (см. Таблицу материалов) для быстрых и стабильных результатов.
- Приготовьте белковый перенос, предварительно замочив фильтровальную бумагу в воде двойной дистилляции и убедившись, что гелевый нож, пластиковая пипетка Пастера, промокательный валик и щипцы готовы к использованию.
- Откройте передаточную стопку, осторожно сняв всю упаковочную пленку. Снимите верхнюю часть с нижней стопки и отложите ее в сторону. Быстро смочите мембрану на нижнем стеке несколькими каплями электрофореза бегущего буфера (2-3 мл). После того как передаточная труба открыта, важно предотвратить высыхание мембраны из ПВДФ.
- После остановки электрофореза откройте предварительно отлитый гель с помощью гелевого ножа и отрежьте стекируемый гель. Разрежьте гель по краям, чтобы освободить его от пластикового слепка. Держите гелевый нож влажным, чтобы не повредить гель.
- Соберите передаточный стек снизу вверх: нижний стек (содержащий мембрану PVDF), протеиновый гель и фильтровальную бумагу. Используйте промокательный валик, чтобы удалить все пузырьки воздуха. Поместите верхнюю стопку поверх фильтровальной бумаги и снова скатайте стопку, чтобы удалить пузырьки воздуха. Не нажимайте слишком сильно, так как это может привести к деформации геля во время переноса белка.
- Перенесите всю стопку в передаточное устройство с электродом с левой стороны устройства и поместите гелевую губку на верхнюю часть стопки так, чтобы она совпала с соответствующими электрическими контактами на устройстве. Закройте крышку, выберите и запустите соответствующую программу (рекомендуется начать с 20 В в течение 7 минут).
- Когда закончите, оставьте крышку закрытой на 2 минуты, чтобы стопка остыла и не высохла мембрана. Снимите передаточный стек и разрежьте мембрану до размера геля. Быстро промойте порезную мембрану дважды дистиллированной водой, прежде чем продолжить окрашивание от общего белка.
4. Общее окрашивание белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование флуоресцентного детектирования дает существенное преимущество по сравнению с более традиционными подходами (например, ECL-детектированием), так как линейный диапазон и чувствительность можно гораздо лучше контролировать. Поэтому на этапах 4 и 5 используют флуоресцентный TPS и флуоресцентные вторичные антитела (см. Таблицу материалов).
- Сверните мембрану в трубку объемом 50 мл стороной белка внутрь. Из-за светочувствительности флуоресцентного TPS и вторичных антител все последующие действия проводятся в темное время суток.
- Добавьте 5 мл раствора для окрашивания белка (см. Таблицу материалов) и выдерживайте на валике в течение 5 минут при комнатной температуре. Поскольку TPS и буфер для промывки содержат метанол, выполняйте эти действия в вытяжном шкафу.
- Выбросьте раствор для окрашивания и быстро дважды промойте 5 мл раствора для стирки (6,3% уксусной кислоты в 30% метанола). Ненадолго поместите трубку обратно на валик между ступенями стирки. Перед тем как продолжить, коротко промойте мембрану сверхчистой водой.
5. Блокирование, инкубация и обнаружение антител
- Блокирование мембраны: Добавьте 3 мл блокирующего буфера (см. Таблицу материалов) в 50 мл пробирки, содержащей мембрану. Инкубируйте мембрану на ролике в течение 30 мин при комнатной температуре. В зависимости от выбора антитела, тип используемого блокирующего буфера может потребовать оптимизации.
- Первичная инкубация антител
- Отбросьте блокирующий буфер и замените его первичным антителом в подходящей, оптимизированной концентрации (Рисунок 1 и Рисунок 2: мышь-анти-SMN, в соотношении 1:1000, разведенный в блокирующем буфере).
заметка: Адекватная оптимизация первичных антител должна включать подтверждение того, что антитело обнаруживает белковый продукт нужного размера, не демонстрируя при этом никакого или минимального связывания с другими, неспецифическими белковыми продуктами. Если возможно, протестируйте и сравните несколько антител против интересующего белка.
- Инкубируйте мембрану на ролике в течение ночи при температуре 4 °C. На следующий день удалите раствор антитела и промойте его 6 раз в течение 5 минут 1x PBS на валике при комнатной температуре (RT).
- Вторичная инкубация антител
- Подготовьте специфическое вторичное антитело в соотношении 1:5000 против хозяина первичного антитела в блокирующем буфере объемом 5 мл. Для других вторичных антител могут потребоваться другие разведения или использование альтернативных блокирующих буферов.
- Инкубировать мембрану с раствором вторичного антитела на ролике в течение 1 ч при ЛТ. После инкубации промыть мембрану трижды по 30 мин 1x PBS на ролике.
- Высушите мембрану и держите мембрану защищенной от света с помощью алюминиевой фольги до обнаружения. Мембраны можно хранить при температуре 4 °C для длительного хранения.
- Получение изображений
- Войдите в систему на компьютере, подключенном к сканеру. Поместите мембрану на сканер стороной белка вниз и выберите область сканирования в программном обеспечении.
- Оптимизируйте интенсивность лазера для обоих каналов (700 нм и 800 нм), убедившись, что насыщения не происходит. Получите изображения в обоих каналах и экспортируйте изображения для дальнейшего анализа (шаг 6).
6. Вестерн-блоттинг и количественная оценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти рекомендации основаны на свободно доступном программном обеспечении Image Studio. Тем не менее, сопоставимый анализ также может быть выполнен с использованием других программных пакетов, таких как ImageJ.
- Импорт файла: Создайте локальное рабочее пространство на компьютере, используемом для анализа. Это генерирует базу данных файлов изображений для приобретенных западных блотов. Импортируйте файлы, полученные на сканере, и выберите изображение для анализа.
- Анализ TPS
- Отобразите канал 700 нм, чтобы показать общий результат окрашивания белка. Пример изображения TPS включен в рисунок 1, на котором непосредственно сравниваются различные ткани неонатальных (P5) (рисунок 1A-B) и 10-недельных мышей (рисунок 1C-D). Аналогично, на рисунке 2 показан пример прямого сравнения тканей мозга мышей разного возраста.
- Выберите вкладку «Анализ» в правом верхнем углу и нажмите «Добавить прямоугольник», чтобы определить область интереса для нормализации (рис. 1B, D). Скопируйте и вставьте первую область прямоугольника в каждый отдельный образец, чтобы убедиться, что определенная область имеет одинаковый размер для всех анализируемых полос.
- Скопируйте результат с вкладки «Фигуры» в левом нижнем углу программы.
- Количественная оценка
заметка: Оптимальный подход к количественному определению образцов зависит от плана эксперимента. Здесь мы приведем наглядный пример обнаружения белка выживающего моторного нейрона (Smn; ключевой белок, участвующий в нервно-мышечном заболевании спинальной мышечной атрофии), который, как известно, уменьшается с течением времени, и того, как нормализация интенсивности сигнала Smn к TPS обеспечивает надежные оценки развития экспрессии белка.
- На рисунке 2 показано снижение экспрессии Smn с увеличением возраста животного с TPS в качестве контроля белковой нагрузки. Повторите шаги 6.2.1-6.2.3 для количественной оценки белковой нагрузки (рисунок 2B). Повторите шаги 6.2.1-6.2.3 в канале 800 нм (рисунок 2A) для анализа интересующего белка.
- Скопируйте результаты опроса TPS и интересующего вас белка в программу для работы с электронными таблицами. В таблице сначала нормализуйте белковую нагрузку, определив наивысший сигнал TPS и разделив каждое значение сигнала TPS на это значение, чтобы получить нормализованное значение белковой нагрузки.
- Разделите значение сигнала 800 нм от каждого отдельного образца на соответствующее нормализованное значение белка, чтобы рассчитать относительный коэффициент экспрессии белка в разных образцах.
- После первой нормализации сравните различные временные точки или ткани со средним значением внутреннего стандарта, чтобы обеспечить прямое сравнение различных мембран и экспериментов.
