Одноклеточный вестерн-блоттинг для определения гетерогенности клеток

Аннотация

Источник: Wang, L., et al., Количественная оценка хемотаксической активности моноцитов in vivo и характеристика макрофагов, полученных из моноцитов крови. J. Vis. Exp. (2019).

В видео описывается метод вестерн-блоттинга с одной клеткой, который идентифицирует состав отдельных клеток, захваченных на чипе вестерн-блоттинга с одной клеткой в гетерогенной суспензии. Метод определяет интенсивность флуоресценции флуорофора, помеченного белковым маркером, специфичным для клетки-мишени.

Протокол

1. Определение клеточного состава в клеточной суспензии с помощью анализа одноклеточного вестерн-блоттинга (scWB)

1. Регидратируйте чип scWB перед использованием в 15 мл 1x суспензионного буфера в чашке Петри в течение не менее 10 минут при РТ.
2. Добавьте 1 мл разбавленной одноклеточной суспензии (10 000-100 000 клеток/мл) в регидратированный чип. Установите поверхность на дно чашки Петри диаметром 10 см. Убедитесь, что поверхность ровная.
3. Накройте чашку Петри крышкой, чтобы предотвратить высыхание, и дайте ячейкам отстояться в течение 5-15 минут с уклоном.
4. Поместите чип под светлопольный микроскоп и осмотрите лунки при 10-кратном увеличении.
   заметка: Примерно 15-20% микролунок должны быть заняты одной ячейкой, а менее 2% лунок должны содержать 2 и более ячеек.
5. Наклоните чашку Петри на 10 см с чипом на 45 градусов.
6. Промойте чип с помощью суспензионного буфера 1x, чтобы удалить незахваченные клетки с поверхности чипа путем аккуратного пипетирования сверху вниз чипа. Повторите 3 раза.
7. Подготовьте одноклеточный вестерн-инструмент.
8. Установите время лизиса, время электрофореза и время захвата ультрафиолета. Для анализа рекрутированных макрофагов, выделенных из гелевой пробки, полученной из базальной мембраны, используйте следующие настройки: время лизиса: 0 с; время электрофореза: 160 с; Время захвата ультрафиолета 240 с.
9. Осторожно загрузите чип в ячейку электрофореза одноэлементного западного инструмента, обращенной к гелевой стороне. Соблюдайте осторожность, чтобы не повредить гелевую сторону чипа.
10. Залейте лизис/бегущий буфер в камеру и полностью покройте весь одноклеточный западный чип. Запустите лизис клеток.
11. Запустите прибор scWB, используя настройку, указанную в пункте 1.8.
12. После завершения прогона переложите чип в чашку Петри диаметром 10 см и дважды промойте чип с 1x буфером для промывки в течение 10 минут при RT.
13. Готовят разведения первичного антитела (анти-винкулина: 1:10; анти-CD45: 1:15, анти-CD11b: 1:20, анти-F4/80: 1:10) в общем объеме 80 мкл разбавителя антитела (смешайте 8 мкл антитела 1 плюс 8 мкл антитела 2 плюс 64 мкл разбавителя).
14. Добавьте 80 мкл первичного раствора антитела в зондирующую камеру антител и опустите чип гелеобразной стороной вниз так, чтобы раствор антитела отводился поперек чипа.
15. Инкубировать с первичным раствором антител в течение 2 ч при ЛТ.
16. Промойте чип три раза в течение 10 минут в буфере для промывки 1x на шейкере.
17. Промойте чип один раз в течение 10 минут в воде на шейкере, чтобы обессолить гель.
18. Приготовьте разведение вторичного антитела в соотношении 1:20 в общем объеме 80 мкл (смешайте 2 мкл вторичного антитела плюс 78 мкл разбавителя).
19. Инкубируйте чип со вторичным антителом в течение 1 ч при ЛТ, защищенном от света.
20. Промойте чипсы три раза в течение 10 минут с помощью 1x промывочного буфера на шейкере.
21. Вращайте чип с помощью вращающегося ползуна, чтобы удалить остатки буфера для промывки.
22. Отсканируйте чип на двухлазерном микрочиповом сканере с разрешением 5 мкм в спектральном канале флуорофора, связанного с вторичными антителами.
23. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения, специфичного для scWB.

2. Снятие чипа scWB

1. Храните отсканированный чип в буфере для стирки до тех пор, пока он не будет готов к снятию изоляции.
2. Поместите водяную баню в вытяжной шкаф
.
3. Поместите штатив для пробирок объемом 50 мл в водяную баню, вода которой находится всего в 1 см над штатиром, и установите температуру воды на уровне 60 °C.
4. Подготовьте буфер для зачистки. Для получения 1 л буферного раствора для отпаривания растворите 9,85 г Tris-HCl (pH 6,8) и 20 г SDS в 900 мл дистиллированной воды и отрегулируйте pH. Затем залейте дистиллированной водой до 1 л. Добавляйте 0,8% (v/v) β-меркаптоэтанола (β-ME; 14,3 M) непосредственно перед каждым использованием.
5. После первоначального сканирования поместите чип в чашку Петри диаметром 10 см перед зачисткой.
6. Для каждого чипа берут 40 мл буфера для отпаривания и добавляют 320 мкл β-ME.
   ВНИМАНИЕ: β-ME токсичен и опасен для человека и окружающей среды. Следующую процедуру следует проделать в вытяжном шкафу.
7. Поместите чип в канистру и закройте канистру парапленкой, чтобы предотвратить попадание воды в канистру
8. Поместите канистру внутрь решетки для трубок на предварительно подогретую водяную баню.
9. Выдерживать в течение 90 минут.
10. Аккуратно выньте чипс из канистры и поместите его в свежую чашку Петри.
11. Коротко промойте чип один раз с помощью буфера для промывки 1x. Затем добавьте в чашку Петри 15 мл 1x моющего буфера.
12. Промойте чипсы в течение 15 минут на шейкере. Повторите шаг стирки четыре раза.
    заметка: Чип готов к введению следующего первичного антитела (см. шаги 1.12 - 1.21)

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Чашка Петри 10 см	Гринер Био-Оун	Тел.: 664 160
10x буфер для суспензии	ПротеинПростой	Р101
Чашка Петри 15 см	сокол	353025
2-Меркаптоэтанол	МП БИОМЕДИЦИНА	2194705
5% буфер для стирки	ПротеинПростой	Р252
Разбавитель антител	ПротеинПростой	Номер 042-203
Настольная центрифуга	Бекман Коултер		Центрифуга Microfuge 22R
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А7906-100Г
Кальцеин AM	ТермоФишер	С3099	1 мл
CD11b	Компания Novus Biologicals	НБ110-89474
CD45 (D4H7K) кролик mAb	Технологии сотовой связи	727987С
CD68/SR-D1 (FA-11)	Компания Novus Biologicals	НБП2-33337СС
Зрение на основе целлометра	Nexcelom
Диспайз	БД	354235	100 мл
Ножницы для препарирования
Вторичное антитело Donkey anti-Rabbit IgG [NL557]	Компания Novus Biologicals	НЛ004	NL 557 конъюгированный
Ослиное вторичное антитело к крысиному IgG (H+L) [DyLight 650]	Компания Novus Biologicals	НБП1-75655	DyLight 650 конъюгированный
F4/80 (CI-A3-1)	Компания Novus Biologicals	НБ600-404СС
Тепловой блок	Эффендорф	No 22331	Термомиксер
Лизис/Бегущий буфер	ПротеинПростой	Р200
Матрица Матригеля (сниженный фактор роста)	БД	354230 (Английский	10 мл
Микрочиповый сканер	ПеркинЭлмер	Сканер ScanArray Gx
Микроцентрифужная пробирка	Научный центр Фишера	Тел.: 05-408-129
микроскоп	ТермоФишер	Evos fl
Майло	ПротеинПростой		Одноклеточный вестерн
игла	БД	305111	26 Г
Парафильм
Зондирующая камера	ПротеинПростой	035-020 (Английский
Рекомбинантный мышиный белок CCL2/JE/MCP-1	НИОКР	479-JE-050
Чип scWEST	ПротеинПростой	С300
шейкер	Биоэкспресс		Орбитальный шейкер для спаривания генов
Одноклеточный западный контейнер для стружки	ПротеинПростой	035-118
Вращающийся слайд	Лабнет	С1303-Т
Додецилсульфат натрия (SDS)	Научный центр Фишера	БП 166-500
шприц	БД	309602	1 мл
Трис-гидрохлорид	Научный центр Фишера	БП 153-500
выщипывать пинцетом	ПротеинПростой	035-020 (Английский
Водяная баня	ТермоФишер

) ) )