Хемилюминесцентный вестерн-блоттинг для переработки белка

Аннотация

Источник: Hillert-Richter, L. K. et al., Измерение состава сигнального комплекса CD95, вызывающего смерть, и процессинг прокаспазы-8 в этом комплексе. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео описывает вестерн-блоттинг иммунопреципитированных лизатов на основе хемилюминесценции. Этот метод помогает определить процесс обработки и активации белка. Обнаруживаемый хемилюминесцентный сигнал пропорционален уровню переработки белка при его активации.

Протокол

Т-клеточные эксперименты проводились в соответствии с этическим соглашением 42502-2-1273 Uni MD.

1. Подготовка клеток к эксперименту

ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее количество клеток для этого иммунопреципитации составляет 1 × 10⁷. Адгезивные клетки должны быть засеяны за один день до эксперимента так, чтобы в день эксперимента было 1 × 10⁷ клеток.

1. Подготовка адгезивных клеток к эксперименту
   1. Семян 5-8 × 10⁶ адгезивных клеток в 20 мл среды (см. Таблицу материалов к составу) для каждого условия в посуду 14,5 см за сутки до начала эксперимента.
   2. В день эксперимента следите за тем, чтобы клетки на 80-90% сливались и прилипали к чашке. Откажитесь от среды и добавьте свежую среду к прилипшим клеткам.
2. Подготовка суспензионных клеток к эксперименту
   1. Непосредственно перед началом эксперимента осторожно поместите 1 × 10⁷ суспензионных клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для состава) по кондиции в посуде диаметром 14,5 см.
   2. При использовании первичных клеток выделяют первичные Т-клетки в соответствии с ранее описанной процедурой. Обработать первичные Т-клетки 1 г/мл фитогемагглютинином в течение 24 ч, а затем 25 ЕД/мл IL2 в течение 6 дней.
   3. Осторожно поместите 1 × 10⁸ первичных Т-клеток в 10 мл питательной среды (см. Таблицу материалов для состава) в соответствии с кондицией в посуду диаметром 14,5 см непосредственно перед началом эксперимента.
      заметка: Рекомендуется большее количество первичных Т-клеток, так как эти клетки меньше.

2. Стимуляция CD95L

1. Стимулируйте клетки с помощью CD95L (полученного, как описано ранее, или коммерчески доступного (см. Таблицу материалов).
   заметка: Концентрация CD95L и время стимуляции зависят от типа клеток. Подготовьте одно условие стимуляции дважды, чтобы параллельно получить образец для контроля бусин.
   1. Стимулируйте адгезивные клетки выбранной концентрацией CD95L. Держите планшет под углом и пипетируйте лиганд в среду, не касаясь адгезивных клеток.
   2. Стимулируйте суспензионные клетки CD95L путем пипетирования раствора лиганда в клеточную суспензию.

3. Сбор и лизис клеток

1. Поставьте клеточные тарелки на лед.
   заметка: Не стоит выбрасывать носитель. Умирающие клетки плавают в среде и важны для анализа.
2. Добавьте 10 мл холодного фосфатно-солевого буфера (PBS) в клеточную суспензию и соскребите прикрепленные клетки с пластины. Соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 50 мл.
3. Дважды промойте камеру 10 мл холодной PBS и поместите раствор для мытья в ту же пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C.
4. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл холодного PBS. Переложите клеточную суспензию в пробирку объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу с 1 мл холодного PBS.
6. Центрифугируйте клеточную суспензию при 500 × г в течение 5 мин, 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу 1 мл буфера для лизиса (содержащего 4% коктейль ингибиторов протеазы). Инкубируйте его в течение 30 минут на льду.
7. Центрифугируйте лизат с максимальной скоростью (~17 000 × г) в течение 15 мин, 4 °C.
8. Перенесите надосадочную жидкость (лизат) в чистую пробирку. Выбросьте гранулы. Возьмите 50 μл лизата в другую пробирку. Проанализируйте концентрацию белка по Брэдфорду и возьмите количество лизата, соответствующее 25 мкг белка во флаконе. Добавьте в флакон загрузочный буфер (см. Таблицу материалов для состава). Хранить при температуре -20 °C в качестве контроля лизата.

4. Иммунопреципитация (IP)

1. Добавьте в лизат 2 мкл антител анти-APO-1 и 10 мкл гранул сефарозы протеина А (приготовленных в соответствии с рекомендациями производителя). Добавьте всего 10 мкл шариков в отдельную пробирку, содержащую лизат (стимулированный образец), чтобы получить «контроль над шариками><». заметка: Используйте наконечники пипеток с широкими отверстиями, либо срезав кончики, либо купив специальные наконечники для IP при работе с шариками сефарозы белка А.
2. Инкубируйте смесь лизата с антителами/белком А сефарозы в осторожном перемешивании в течение ночи при 4 °C. Центрифугируйте лизаты с антителами/белком А сефарозы при 500 × г в течение 4 мин, 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость, добавьте 1 мл холодного PBS в бусины и повторите этот шаг не менее трех раз.
3. Выбросьте надосадочную жидкость. Отсасывайте шарики предпочтительно с помощью шприца Hamilton объемом 50 мкл.

5. Вестерн-блот

1. Добавьте 20 μL 4x загрузочного буфера (см. Таблицу материалов для состава) в гранулы и нагревайте при 95 °C в течение 10 мин. Нагревайте регуляторы лизата при 95 °C в течение 5 мин.
2. Загрузите лизаты, IPs и стандарт белка в гель с 12,5% додецилсульфатом натрия (SDS) (см. Таблицу материалов для получения геля) и запустите с постоянным напряжением 80 В.
3. Перенесите белки из геля SDS на нитроцеллюлозную мембрану.
   заметка: Здесь был использован полусухой метод, оптимизированный для интересующих белков, для переноса в течение 12 мин (25 В; 2,5 А = постоянная). Замочите нитроцеллюлозную мембрану и два мини-размера в буфере для электрофореза (см. Таблицу материалов для состава, готовьте в соответствии с инструкциями производителя) на несколько минут перед западным блоттингом.
4. Поместите промокающую мембрану в коробку и заблокируйте ее на 1 ч в блокирующем растворе (0,1% Tween-20 в PBS (PBST) + 5% молока). Инкубируйте мембрану с блокирующим раствором при осторожном перемешивании.
5. Промойте мембрану три раза PBST по 5 минут после каждой стирки.

6. Обнаружение вестерн-блоттинга

1. Добавьте первое первичное антитело в указанном разведении (см. Таблицу материалов) к мембране и инкубируйте его в течение ночи при 4 °С при осторожном перемешивании.
2. Промойте мембрану три раза PBST по 5 минут после каждой стирки.
3. Инкубируйте мембрану с 20 мл вторичного антитела (разведенного в соотношении 1:10 000 в PBST + 5% молока) с легким встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Промойте мембрану три раза PBST по 5 минут после каждой стирки.
5. Выбросьте ПБСТ и добавьте в мембрану примерно 1 мл субстрата пероксидазы хрена.
6. Обнаружение хемилюминесцентного сигнала (см. Таблицу материалов).
   заметка: Время экспозиции и количество получаемых изображений зависят от количества белка в клетке и специфичности используемых антител. Он должен быть установлен эмпирически для каждого антитела, используемого для обнаружения.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
12,5% гель SDS	Самодельный		Для двух разделительных гелей: 3,28 мл дистиллированного H2O 2,5 мл Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 мл акриламида 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7,5 μL TEMED для двух собирающих гелей: 3,1 мл дистиллированного H2O 1,25 мл Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 мл акриламида 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7,5 μL TEMED
Клеточная посуда 14,5 см	Грейнер	Номер 639160
Акриламид	Карл Рот	А124.1
Наконечники для дозатора аэрозольного фильтра с фильтром с высокой степенью восстановления и широким отверстием	ВВР	46620-664 (Северная Америка) или 732-0559 (Европа)	Используется для пипетирования бусин в лизат
Используется для пипетирования бусин в лизат	Сигма Олдрич	А2103	Разбавление: 1:4000 в PBST + 1:100 NaN3
анти-АПО-1 АБ	Предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено компанией ENZO	АЛКС-805-038-К100	Используется только для иммунопреципитации
антикаспазы-10 Ab	Биозол	МБЛ-М059-3	Разбавление: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
антикаспазы-3 Ab	Клеточная сигнализация	9662 С	Разбавление: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
антикаспазы-8 Ab C15	Предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено компанией ENZO	АЛКС-804-242-К100	Разбавление: 1:20 в PBST + 1:100 NaN3
анти-CD95 Ab	Санта-Крус	СК-715	Разбавление: 1:2000 в PBST + 1:100 NaN3
анти-c-FLIP NF6 Ab	Предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено компанией ENZO	АЛКС-804-961-0100	Разбавление: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
анти-FADD 1C4 Ab	Предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено компанией ENZO	АДИ-ААМ-212-Э	Разбавление: 1:10 в PBST + 1:100 NaN3
анти-PARP Ab	Клеточная сигнализация	9542	Разбавление: 1:1000 в PBST + 1:100 NaN3
АПС	Карл Рот	9592.3
β-меркаптоэтанол	Карл Рот	4227.2
Bradford solution Protein Assay Концентрат красителя 450мл	Био Рад	500-0006	Используется в соответствии с инструкцией производителя
КД95Л	Предоставлено в этих экспериментах профессором. Краммером или может быть приобретено компанией ENZO	АЛКС-522-020-К005
Хемилюминесцентный детектор Chem Doc XRS+	Био Рад
Полный коктейль ингибиторов протеазы (PIC)	Сигма Олдрич	АЛКС-522-020-К005	Приготовлено в соответствии с инструкциями производителя
DPBS (10x) без Ca, Mg	ПАН Биотех	П04-53500	Разведение 1:10 с H2O, хранение в холодильнике
Буфер для электрофореза	Самодельный		10x Буфер для электрофореза: 60,6 г Tris 288 г глицина 20 г SDS и 2 л H2O 1:10 разведение перед использованием
глицин	Карл Рот	No 3908.3
Козий антимышиный IgG1 HRP	SouthernBiotech	1070-05	Разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Козий антимышиный IgG2b HRP	SouthernBiotech	1090-05	Разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Козий антикролиачий IgG-HRP	SouthernBiotech	4030-05	Разведение 1:10.000 в PBST + 5% молока
Интерлейкин-2 человека (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Для активации Т-клеток
KCl	Карл Рот	Номер 6781.2
КХ2ПО4	Карл Рот	3904.1 Телефонный режим 3904.1
Загрузочный буфер 4x Laemmli Sample Buffer, 10 мл	Био Рад	161-0747 (Английский	Приготовлено в соответствии с инструкциями производителя
Подложка Luminata Forte Western HRP	Многородность	WBLUFO500
Буфер для лизиса	Самодельный		13,3 мл Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 М 27,5 мл NaCl; 5 М 10 мл ЭДТА; 2 мМ 100 мл Triton X-100 добавить 960 мл H2O
Среда для адгезивных клеток DMEM F12 (1:1) со стабильным глутамином, 2,438 г/л	ПАН Биотех	П04-41154	Добавление в среду 10% FCS, 1% пенициллин-стрептомицина и 0,0001% пуромицина
Среда для первичных Т-клеток	gibco от Life Technologie	21875034	Добавление в среду 10% FCS и 1% пенициллин-стрептомицина
Сухое молоко	Карл Рот	Т145.4
На2НПО4	Карл Рот	П030.3
NaCl	Карл Рот	3957.2 Кабельный терминал No 3957.2
ПБСТ	Самодельный		20x PBST: 230 г NaCl 8 г KCl 56,8 г Na2HPO4 8 г KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Страница 3 из 3 20 мл Tween-20 ad 2 л H2O разведение 1:20 перед использованием
ПБСТ + 5% молока	Самодельный		50 г сухого молока + 1 л PBST
ПГА	Thermo Fisher Scientific	R30852801	Для активации Т-клеток
Пауэр Пак HC	Био Рад
Precision Plus Protein Standard All Blue	Био Рад	161-0373 (Английский)	Используйте от 3 до 5 μл
Протеин А Сефароза CL-4B в гранулах	Новодирект/ Т.Гейер	ГЭ 17-0780-01	Гранулы смолы affinity приготовлены в соответствии с инструкциями производителя
скребок	ВВР	734-2602
Паспорт безопасности	Карл Рот	4360.2
шейкер	Гейдольф
Азид натрия	Карл Рот	К305.1
ТЕМЕД	Карл Рот	2367.3
Trans Blot Turbo мини-стеки для переноса	Био Рад	170-4270	Используется в соответствии с инструкцией производителя
Буфер для переноса TransBlot Turbo 5x	Био Рад	10026938	Приготовлено в соответствии с инструкциями производителя
Мембрана из никтроцеллюлозы TransBlot Turbo Mini-размер	Био Рад	170-4270	Используется в соответствии с инструкцией производителя
Транс-Блот-Турбо	Био Рад
Трис	Химическое растворенное вещество	8,08,51,000
Тритон Х-100	Карл Рот	3051.4 Телефонный знак 3051.4
Подросток-20	Пан Реак Аппли Кем	А4974,1000

Телефон гг. гг. ) См.