$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантные белки, использованные в этом исследовании, Hsp90 и Cdc37, были получены коммерчески (см. Таблицу материалов).
1. Активация чипа
ПРИМЕЧАНИЕ: Все материалы, которые будут использоваться в эксперименте, перечислены в таблице материалов. Все приготовленные растворы профильтровать через стерильный фильтр 0,2 мкм.
- Приготовьте раствор 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDC), добавив 2 мг EDC к 2,5 мл 1 М буфера 2-(N-морфолино) этансульфоновой кислоты (MES) (pH = 6,0) в пробирке объемом 15 мл. Приготовьте растворы N-гидроксисульфосукцинимида (сульфо-NHS) путем добавления 6 мг сульфо-NHS к 2,5 мл буфера 1 М MES (pH = 6,0) в отдельную пробирку объемом 15 мл. Аликвотьте по 50 мкл каждого раствора в отдельных пробирках и храните при -20 °C для дальнейшего использования.
- Смешайте равные объемы EDC и раствора sulfo-NHS (50 мкл EDC + 50 мкл sulfo-NHS) путем пипетирования вверх и вниз (не завивайте).
ПРИМЕЧАНИЕ: Смешанный раствор EDC/sulfo-NHS необходимо использовать в течение 30 минут для поддержания эффективного сшивания для надлежащей функционализации чипа.
- Поместите биосенсорный чип (5,7 см х 2,4 см; см. Таблицу материалов), поставляемый компанией, в стеклянную чашку Петри с крышкой. Все этапы функционализации, связанные с активацией чипа, предлагается выполнять в чашке Петри. Нанесите 50 мкл буфера 1 М MES (pH = 6,0) на чип биосенсора, инкубируйте в течение 1 мин при комнатной температуре, а затем отасуньте буфер.
- Немедленно нанесите 50 мкл раствора EDC/sulfo-NHS на чип датчика. Накройте чашку Петри крышкой и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре. Асасируйте раствор EDC/sulfo-NHS из чипа.
- Промойте чип один раз 50 μL 1 М MES-буфера (pH = 6,0); аспирируйте MES-буфер.
2. Иммобилизация целевого белка
- Промойте чип 2 раза 50 мкл 1x PBS (pH = 7,4). Отберите PBS из чипа и добавьте целевую молекулу Hsp90 (50 μL; 500 нМ).
ПРИМЕЧАНИЕ: Несоответствие буфера может испортить весь эксперимент; следовательно, перед экспериментом важно убедиться, что молекула-мишень находится в том же буфере, что и тот, который используется для калибровки (например, 1x PBS (pH = 7,4)). При необходимости перед экспериментом проведите замену буфера путем ночного диализа. В этом эксперименте проводился ночной диализ для обоих рекомбинантных белков, Hsp90 и Cdc37, против 1x PBS (pH = 7,4; см. Таблицу материалов) при надлежащем обмене буфера при 4 °C. Концентрация целевого материала (в данном случае Hsp90) может варьироваться в зависимости от различных экспериментальных протоколов и природы целевых материалов (белок/пептид/лиганды).
- Накройте стеклянную чашку Петри крышкой и выдерживайте 30 минут при комнатной температуре. Отсадите раствор, содержащий целевую молекулу, и промойте 3 раза 50 мкл 1x PBS (pH = 7,4). Аспирируйте 1x PBS (pH = 7,4) раствор из чипа.
- Добавьте в чип 50 μл раствора Quench 1 (3,9 мМ амино-PEG5-спирта в 1x PBS (pH = 7,4)). Накройте стеклянную чашку Петри крышкой и выдерживайте в течение 15 минут при комнатной температуре. Аспирируйте раствор Quench 1 из чипа.
- Добавьте в чип 50 мкл раствора Quench 2 (1 М этаноламин (pH = 8,5)). Накройте стеклянную чашку Петри крышкой и выдерживайте 15 минут при комнатной температуре. Отсадите раствор Quench 2 из чипа и промойте чип 5x с использованием 50 μL 1x PBS, оставив последнюю каплю PBS на датчике.
3. Подготовка образцов аналита
- Приготовьте серию разведения аналита для Cdc37 в желаемом диапазоне концентраций. Для первого эксперимента использовались следующие концентрации: 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 800 нМ, 1000 нМ, 2000 нМ, 3000 нМ и 5000 нМ. Для второго эксперимента использовался другой набор концентраций в диапазоне от 0,4 нМ до 200 нМ.
- Спланируйте эксперимент таким образом, чтобы включить не менее восьми различных концентраций аналита для получения надежного значения KD. Готовьте различные разведения аналитного белка в том же буфере, который используется для калибровки и целевого белка; здесь он равен 1x PBS (pH = 7,4).
4. Загрузка активированного чипа биосенсора в устройство FEB
ПРИМЕЧАНИЕ: Устройство FEB состоит из считывателя со светодиодной индикацией и картриджа для вставки биосенсорного чипа.
- После иммобилизации целевого белка активированный чип вставляют в картридж устройства, который подключается через USB к компьютеру. После вставки чипа на считывателе загорится зеленый светодиодный индикатор, указывающий на то, что устройство FEB готово к эксперименту. Установите автоматизированное программное обеспечение (см. Таблицу материалов), поставляемое компанией, на компьютер, к которому подключено устройство FEB, чтобы контролировать эксперимент шаг за шагом, как описано ниже.
5. Запустите эксперимент
- Нажмите на модуль Run Experiment в автоматизированном программном обеспечении и выберите 10 Points with Regeneration или любой другой желаемый протокол. Заполните следующие данные: имя оператора, название эксперимента, дату (например, Яна, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); буфер регенерации (например, буфер PBS); обездвиженная мишень (например, Hsp90); аналит в растворе (например, Cdc37).
- Нажмите кнопку «Начать эксперимент», отображаемую на программном обеспечении, и следуйте инструкциям автоматизированного программного обеспечения, как описано ниже.
заметка: Программное обеспечение полностью автоматизировано, удобно для пользователя и шаг за шагом направляет пользователя на протяжении всего эксперимента. На экране появится всплывающее окно с инструкциями для дальнейших действий на каждом этапе эксперимента. Программное обеспечение будет предоставлять инструкции для каждого повторяющегося шага последовательно от калибровки, ассоциации аналита, диссоциации, регенерации и промывки (5 раз) для каждой концентрации аналита на протяжении всего эксперимента.
- Выполните калибровку прибора. Для этого отсасывайте оставшийся раствор PBS из чипа и вносите 50 μл калибровочного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 5 минут, пока этап калибровки не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку, определенную для шага калибровки (5 минут), с предупредительным сигналом тревоги, который необходимо выполнить.
- Далее выполните ассоциацию аналита. Для этого отсадите калибровочный буфер из чипа и внесите 50 мкл самой низкой концентрации аналита (25 нМ Cdc37). Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 5 минут, пока шаг ассоциации не будет завершен. Программное обеспечение отображает конечную точку для шага ассоциации (5 минут) с предупредительным сигналом о начале работы.
- Выполните диссоциацию аналита. Для этого необходимо аспирировать раствор аналита из чипа и ввести 50 мкл диссоциативного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 5 минут, пока не закончится продолжительность шага диссоциации (5 минут). Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа диссоциации (5 минут) с предупредительным сигналом тревоги, который необходимо выполнить.
- Далее выполняем регенерацию стружки. Отсадите диссоциативный раствор из чипа и внесите 50 μл регенерационного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 30 с, пока не закончится продолжительность шага регенерации (30 с). Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа регенерации (30 с) с предупредительным сигналом тревоги для последующих действий.
- Наконец, промойте чип. Отсадите регенерационный раствор из чипа и нанесите на чип 50 μл промывочного буфера (1x PBS; pH = 7,4). Откачайте раствор из чипа и повторите это 5 раз. Оставьте последнюю каплю буфера промывки на чипе, нажмите кнопку «Продолжить» и подождите 30 с, пока на дисплее программного обеспечения не закончится продолжительность этапа стирки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение отображает конечную точку для этапа стирки (30 с) с предупреждающим сигналом для продолжения следующего цикла эксперимента.
- Повторите шаги для каждой используемой концентрации аналита; пять этапов калибровки, ассоциации аналита, диссоциации, регенерации и промывки (5x) составляют один цикл. Для показанного здесь эксперимента мы выполнили 10 циклов для 10 концентраций аналита (в диапазоне от 25 нМ до 5 000 нМ или от 0,4 нМ до 200 нМ; Рисунок 1).
