Методы детектирования биомолекулярных взаимодействий

В этом видео мы описываем технологию полевого биосенсоринга (FEB) для обнаружения и количественной оценки белок-белковых взаимодействий. Белки-мишени, иммобилизованные на графеновом биосенсоре, взаимодействуют с белками аналита в растворе, что приводит к изменениям электрического тока в системе FEB. Это изменение электрического отклика указывает на аффинность связывания между белками.

В этом видео мы демонстрируем использование массовой фотометрии для изучения взаимодействий антиген-антитело в проточной камере. Сфокусированный свет рассеивается по-разному в зависимости от массы молекул. Детектор собирает рассеянный свет и генерирует интерференционную картину в виде пятен различной интенсивности, которые коррелируют с молекулярными массами.

В видео описывается метод визуализации FLIM-FRET для определения белок-белкового взаимодействия у живых бактерий, экспрессирующих цитоплазматические белки, меченные флуоресцентными белками, донора eGFP и акцептора mCherry. Комбинированный метод также позволяет количественно оценить взаимодействующие белки.

В этом видео мы демонстрируем технику измерения трансклеточных взаимодействий между молекулами адгезии синаптических клеток с помощью анализа агрегации клеток HEK. В этом анализе равное количество HEK-клеток, экспрессирующих желаемую молекулу пресинаптической клеточной адгезии и флуоресцентный белок, смешивают с HEK-клетками, экспрессирующими постсинаптическую молекулу клеточной адгезии и другой флуоресцентный белок. Взаимодействие между молекулами клеточной адгезии заставляет клетки...

Это видео описывает анализ близости-лигирования для изучения белково-белковых взаимодействий in situ в клетках нематоды. Непосредственная близость представляющих интерес белков генерирует кольцевую матрицу ДНК с помощью зонда PLA, прикрепленного к вторичному антителу. Зонд дополнительно амплифицируется с помощью раствора для амплификации, который производит длинную одноцепочечную ДНК с последующей гибридизацией детекторного зонда, что позволяет локализовать белок-белковые взаимодействия в...

Это видео демонстрирует ко-иммунопреципитированные белковые комплексы на мембране PVDF для анализа белок-белкового взаимодействия. Восстановленные белки из комплексов обрабатывали трипсином, чтобы расщепить отдельные белки на более мелких пептидах, затем оставшиеся пептиды экстрагировали из мембраны PVDF. Вытянутый пептид, полученный из обоих белков в комплексе, затем высушивали и ресуспендировали в низкой концентрации муравьиной кислоты для дальнейшего анализа.

В этом видео мы демонстрируем технологию биослойной интерферометрии (BLI) для обнаружения межмолекулярных взаимодействий между лигандами и целевыми аналитами в режиме реального времени. BLI измеряет изменения интерференционной картины белого света, отраженного от слоя иммобилизованных лигандов на поверхности биосенсора при их взаимодействии с аналитами в растворе.

Это видео демонстрирует использование флуоресцентной флуктуационной спектроскопии для обнаружения взаимодействия между белками клеточной поверхности при межклеточных контактах. Путем экспрессии интересующего нас рецептора трансмембранной адгезии, меченного флуоресцентным белком, и смешивания двух различных клеточных популяций, содержащих две спектрально разделенные флуоресцентные метки, трансвзаимодействие между рецепторами двух соседних клеток с разной цветовой флуоресценцией оценивается...

В этом видео мы демонстрируем метод проведения ко-иммунопреципитации GFP-меченых белков дикого типа и мутировавших белков PD-1 с использованием гранул, покрытых антителами против GFP. Связанные с гранулами белки PD-1-GFP инкубируются с белками SHP2, которые взаимодействуют с PD-1, что позволяет идентифицировать специфические структурные мотивы в PD-1, которые играют решающую роль во взаимодействии SHP2.

В этом видео описывается метод на основе ИФА, который обнаруживает белок-белковые взаимодействия между двумя белками путем измерения связывания второго белка с иммобилизованным первым белком. Связанный второй белок обнаруживается с помощью специфических антител, меченных ферментом, таких как пероксидаза хрена.

Это видео демонстрирует кондуктивный биосенсорный анализ для изучения взаимодействия антитела с целевым антигеном, иммобилизованным на чипе преобразователя. Биосенсор спроектирован таким образом, чтобы иметь бифункциональный химерный белок — фермент β-лактамазу с функциональным каталитическим центром, слитый с нанотелом для связывания с иммобилизованным антигеном-мишенью. При связывании каталитический гидролиз субстрата антибиотика ферментом β-лактамазой генерирует электрический сигнал,...

Это видео демонстрирует технику, которая использует биотинилированные пептиды, проникающие в клетки, для обнаружения внутриклеточных белок-белковых взаимодействий. Пептиды, проникающие в клетку, способствуют проникновению конъюгированного пептида в клетку и специфически связываются с взаимодействующими с ней белками. Биотин, связываясь с авидином, позволяет очищать комплекс взаимодействующих белков от клеточного лизата.

Это видео демонстрирует двухгибридный анализ дрожжей для обнаружения специфических белковых взаимодействий. В этом анализе интересующий белок помечен двумя доменами транскрипционного фактора, который кодирует фермент β-галактозидазу. Когда два белка взаимодействуют, это приводит к транскрипции и трансляции с образованием фермента, который затем обнаруживается с помощью биохимического анализа.

Это видео демонстрирует тандемную аффинную очистку — метод очистки белковых комплексов из эукариотических клеток для изучения белок-белкового взаимодействия. Комплекс содержит два белка, меченных разными эпитопными метками. При последовательной очистке комплекса с использованием двух смол со сродством к двум различным меткам, присутствие обоих белков в элюировании подтверждает взаимодействие между ними.

Это видео описывает метод поверхностного плазмонного резонанса, или SPR, для изучения взаимодействия между двумя молекулами с помощью сенсорного чипа. Изменение угла резонанса и интенсивности отраженного света обнаруживается как функция ассоциации и диссоциации двух молекул, что дает информацию о взаимодействиях между двумя молекулами.

Это видео описывает метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса для изучения белок-белковых взаимодействий между 15N-мечеными белками дикого типа и мутантными белками энвоплакина и немеченым белком виментином. Успешное взаимодействие энвоплакина дикого типа и виментина приводит к обширному уширению линии и исчезновению пиков в спектрах ЯМР, в то время как отсутствие взаимодействия между мутировавшим энвоплакином и виментином приводит к хорошо разрешенным пикам в спектрах ЯМР.

В этом видео мы демонстрируем технику фагового дисплея для выделения предварительно сконструированных фагов, экспрессирующих белки с высоким сродством к белку-мишени.

Это видео демонстрирует технику флуоресцентной флуктуационной спектроскопии (FFS) для изучения гомоолигомеризации белков. Флуоресцентно меченные белки в образце димеризуются с помощью агента при изучении олигомеризации белка с помощью FFS. С помощью конфокального микроскопа по мере того, как белки входят и выходят из малого объема наблюдения, проводится анализ колебаний яркости флуоресцентных молекул для определения олигомерного состояния белков.

В этом видео описывается BiFC-PALM ― комбинация фотоактивируемой локализации микроскопии и бимолекулярной флуоресцентной комплементации ― для оценки белок-белковых взаимодействий. BiFC включает в себя слияние двух флуоресцентных фрагментов белка с двумя взаимодействующими белками, представляющими интерес. Когда два белка взаимодействуют, фрагменты оказываются в непосредственной близости, что позволяет двум частям объединиться и воссоздать функциональный флуоресцентный белок. Флуоресценция...

В этом видео мы описываем метод флуоресцентной анизотропии для изучения взаимодействия между меченым флуорофором белком синдрома Швахмана-Даймонда (SBDS) и фактором удлинения, подобной 1 ГТФазе (EFL1). При инкубации белков SBDS с постепенно возрастающими концентрациями EFL1 наблюдается устойчивое увеличение анизотропии, что свидетельствует об успешном взаимодействии между двумя белками.

В этом видео мы демонстрируем технику внутриклеточной спектроскопии ядерного магнитного резонанса для изучения белково-лигандных взаимодействий между немечеными сверхэкспрессированными белками и малыми молекулами. Успешное лиганд-белковое взаимодействие подтверждается визуально появлением дополнительного набора пиков в исследуемой спектральной области, который постепенно заменяет исходные пики.

Это видео демонстрирует метод изучения взаимодействия белка и лекарства с использованием биопаннинга на основе биосенсора QCM библиотеки пептидов, отображаемых фагами T7. Биопанирование фагов, отображающих специфический пептид на биосенсоре QCM, позволяет специфически выделять высокоаффинные пептиды с последующим секвенированием аминокислот, что помогает идентифицировать специфические сайты взаимодействия на белке-мишени.

Это видео описывает SEC-MALS, который использует возможности эксклюзионной хроматографии (SEC) и многоугольного светорассеяния (MALS). В SEC-MALS SEC разделяет белки или белковые комплексы в зависимости от их размера, а детектор MALS определяет среднюю молекулярную массу, измеряя интенсивность света, рассеянного молекулой под разными углами.

В этом видео мы продемонстрировали бимолекулярную комплементационную аффинную очистку, BiCAP, для обнаружения и выделения специфических белковых димеров с использованием конформационно-специфичных однодоменных антител.

В этом видео мы описываем конкурентный анализ связывания, основанный на проточной цитометрии, для обнаружения взаимодействий между CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) и его флуоресцентно меченным природным лигандом CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12) в присутствии малой молекулы, нацеленной на CXCR4. Инкубация клеток, экспрессирующих CXCR4, с более низкими концентрациями малых молекул позволяет в некоторой степени связываться с CXCR4-CXCL12, которое постепенно снижается при постепенном увеличении...

Это видео демонстрирует обнаружение взаимодействия рецептор-лиганд на основе репортерного анализа. Успешное взаимодействие рецептор-лиганд активирует нисходящий сигнальный путь, вызывая генерацию и высвобождение цитокинов в виде секреторных репортерных молекул в растворе, что подтверждается с помощью ИФА.

В этом видео биомембранные силовые зонды (BFP) используются для измерения сил между рецепторами и лигандами. Этот метод позволяет обнаруживать взаимодействия, контролируя давление, необходимое для разрыва связей между pMHC, конъюгированными на зондовых шариках, и TCR на клетках-мишенях.

Это видео демонстрирует соревновательный анализ для изучения ГТФаза-связывающих белковых партнеров. Используя связанный с нуклеотидами белок ГТФазы, иммобилизованный на магнитных шариках, можно изучить конкурентное связывание между двумя взаимодействующими белками-партнерами для одного и того же сайта связывания на ГТФазе для оценки аффинности связывания белковых партнеров.

В этом видео мы демонстрируем процесс обнаружения изотипов антител в нескольких образцах сыворотки крови человека с помощью слайда микрочипа, напечатанного с антигенными подтипами штаммов вируса гриппа.

В этом видео мы демонстрируем анализ сдвига электрофоретической подвижности для обнаружения взаимодействий белка и ДНК с помощью инфракрасных флуоресцентных зондов ДНК. Когда белок связывается с зондом ДНК, он образует большой комплекс, который медленно мигрирует дальше и выглядит как смещенная полоса на геле.

В этом видео мы демонстрируем метод иммунопреципитации хроматина для идентификации сайтов связывания белка на определенных участках геномной ДНК клеток-предшественников олигодендроцитов с помощью селективной иммунопреципитации связанных с белками фрагментов хроматина. Этот метод помогает изучить взаимодействие нескольких регуляторных белков, в том числе факторов транскрипции, участвующих в регуляции генов.

Это видео описывает высокоэффективную флуоресцентную анизотропию, которая помогает отслеживать взаимодействие между факторами транскрипции и ДНК. Анализ отслеживает взаимодействие молекулы ДНК, меченной флуорофором, с ее специфическим фактором транскрипции путем измерения степени поляризации из-за вращения молекул или анизотропии меченной флуорофором ДНК.

В этом видео демонстрируется анализ in vivo у бактерий для изучения взаимодействия РНК-связывающих белков (RBP) с РНК. Бактериальные клетки трансформируются с помощью двух плазмидных конструкций — плазмиды с сайтом связывания, кодирующей мРНК, содержащую флуоресцентный репортерный ген, расположенный ниже по течению от RBP-связывающего сайта, в то время как RBP-плазмида экспрессирует белки RBP под контролем индуктора. При индуктор-опосредованном увеличении продукции RBP RBP связываются с мРНК,...

В этом видео мы демонстрируем модифицированный одногибридный анализ дрожжей, который обнаруживает несколько белков, взаимодействующих с целевой ДНК. Трансформированные дрожжевые клетки содержат целевую последовательность ДНК выше репортерного гена. Кроме того, они экспрессируют белки фактора транскрипции. Когда белки образуют комплексы и связываются с целевой ДНК, репортерный ген экспрессируется и может быть обнаружен ферментативно.

В этом видео мы демонстрируем процедуру определения геликазной активности белка-мишени для раскручивания субстрата дцРНК, меченного биотином. Активность фермента была идентифицирована путем анализа электрофоретического сдвига подвижности с последующим хемилюминесцентным анализом с использованием хемилюминесцентного фермента-конъюгированного стрептавидина.

В этом видео мы описываем метод иммунофлуоресценции для визуализации локализации белков репарации ДНК γH2AX и 53BP1 в местах двухцепочечных разрывов ДНК в облученных ядрах клеток.

Это видео демонстрирует анализ in vitro для идентификации РНК-связывающих белков (RBP), которые взаимодействуют с последовательностями элементов, богатых аденилат-уридилатами (ARE) в мРНК. RBP-мишени из клеточного лизата смешиваются с РНК-зондом с образованием комплексов РНК-белок. Комплексы выделяют с помощью аффинной очистки с использованием аффинности метки дестиобиотина РНК-зонда к магнитной бусине, меченной стрептавидином.

В этом видео мы описываем систематическую эволюцию лигандов методом экспоненциального обогащения (SELEX) для идентификации специфических РНК-связывающих последовательностей для интересующего вас белка-мишени. Белок инкубируют с большим пулом рандомизированных последовательностей РНК, а связывающие белки последовательности РНК изолируют, амплифицируют с помощью ПЦР и секвенируют для идентификации их сайтов связывания с белками.

Это видео описывает метод визуализации сборки конденсатов смешанных белков на молекулах ДНК в определенных локусах с помощью визуализации одной молекулы. Эти конденсаты образуются из-за взаимодействий LCD-LCD и LCD-DBD, которые позволяют рекрутировать РНК-полимеразу II и усиливать транскрипцию генов.

Это видео демонстрирует дифференциальную сканирующую калориметрию — метод изучения взаимодействия между биомолекулой и лигандом. Связывание аптамера ДНК и термолабильного лиганда изучается путем применения к образцу повторяющихся циклов нагрева и охлаждения и получения сканов для термодинамического анализа.

Это видео демонстрирует микромасштабный термофорез для изучения белок-липидного взаимодействия. Анализ обнаруживает взаимодействие между молекулами путем количественной оценки термофоретического движения флуоресцентно-меченых белков в ответ на температурный градиент. Флуоресцентную молекулу смешивают с различными концентрациями нефлуоресцентных молекул липидов, и смесь молекул в растворе загружают в капилляры. К образцам в капиллярах применяется температурный градиент, а движение флуоресцентной...

В этом видео мы демонстрируем взаимодействие между белками и искусственными фосфолипидными везикулами с помощью количественной проточной цитометрии. Связывание флуоресцентно меченых белков с флуоресцентно мечеными фосфолипидными везикулами увеличивает среднюю интенсивность флуоресценции, и это увеличение обнаруживается проточным цитометром.

Это видео демонстрирует технику диссипативной микрогравиметрии для исследования связывания белков с липидными бислоями. Мелкие униламеллярные везикулы добавляются для покрытия поверхности кварцевого датчика микровесов. Используя кальций-ионзависимое связывание целевого фосфолипид-связывающего белка с бислоем, отслеживают изменения частоты колебаний сенсора и диссипацию колебаний для определения характера связывания белок-липидного бислоя.

В этом видео мы демонстрируем взаимодействия белка и фосфоинозитида в микрофлюидной картине с использованием анализа модуляции pH, используя чувствительный к pH флуоресцентный краситель, помеченный липидом фосфатидилэтаноламина, поддерживаемого липидного бислоя, называемого микрофлюидной платформой. Модуляции рН после связывания белка с фосфолипидами вызывают гашение флуоресценции.