1. Подготовьте проточные камеры
- Очистите стеклянные покровные стекла
- Используя бутылки для мытья с дистиллированной водой, этанолом и изопропанолом, промойте покровные стекла размером 24 мм x 50 мм в следующем порядке: вода, этанол, вода, изопропанол, вода. Просушите покровные стекла струей чистого азота. Важно промыть покровные листы сверху вниз, придерживая нижний угол щипцами с мягким наконечником. Высушите покровный лист в том же направлении, чтобы избежать переноса загрязнения с щипцов (Рисунок 1A).
- Аналогичным образом промойте покровные стекла размером 24 мм x 24 мм дистиллированной водой, этанолом и дистиллированной водой. Просушите покровные стекла струей чистого азота.
- Определите рабочую сторону покровного стекла, капните каплю дистиллированной воды на поверхность чистого покровного стекла и следуйте шагам 3.1–3.2 протокола. Как правило, только одна сторона покровного стекла размером 24 мм x 50 мм имеет оптическое качество, подходящее для измерений MP.
заметка: После фокусировки не должно быть обнаружено значительных дефектов поверхности, а значение «сигнала», отображаемое в программном обеспечении для сбора данных, должно составлять менее 0,05% (рис. 2A-C). Рабочие стороны всех покровных колпачков в коробке ориентированы в одном направлении. Та же процедура должна быть использована для проверки эффективности очистки покровного стекла.
- Соберите проточную камеру
- Поместите покровную крышку размером 24 мм x 24 мм на кусок алюминиевой фольги. Поместите полоски двустороннего скотча поверх покровного стекла размером 24 мм x 24 мм, как показано на рисунке 1B, и разрежьте ленту по краю стекла. Отделите покровное стекло от алюминиевой фольги и прикрепите его к рабочей стороне покровного стекла размером 24 мм x 50 мм (рис. 1C).
заметка: Размер канала может варьироваться, но рекомендуется ширина 3–5 мм. Более широкие каналы требуют больших объемов выборки, а очень узкие каналы могут быть затруднены для загрузки. Как правило, на покровном стекле размером 24 мм x 24 мм можно легко создать два параллельных канала. Протокол можно поставить на паузу здесь.
2. Подготовьте образцы антител-антигена для измерений аффинности
- Отфильтруйте не менее 2 мл буфера PBS с помощью шприцевых фильтров 0,22 мкм для удаления частиц пыли или агрегатов. Центрифугируйте белковый запас в течение 10 минут на максимальной скорости настольной центрифуги (приблизительно 16 000 x г).
заметка: PBS является рекомендуемым буфером для этого протокола, но MP не имеет особых требований к буферу, и другие биологические буферы также приемлемы. Однако высокие концентрации глицерина (>10%) и очень низкая ионная сила (концентрация соли <10 мМм) могут повлиять на качество изображения и данных и не рекомендуются.
- Определите фактические концентрации антител и запасов антигенов, измерив их поглощение ультрафиолета на длине волны 280 нм.
- Рассчитайте измеренные концентрации смеси антиген-антитело. Если расчетное значение аффинности связывания антител неизвестно, планируют подготовить образец с концентрацией антигена 30 нМ и антител 20 нМ. Когда приблизительное сродство известно, отношение антител к антигенам и их концентрации должны быть оптимизированы в соответствии с ожидаемыми значениями Kd. Используйте общую концентрацию антигена в смеси, равную сумме ожидаемого Kd и общей концентрации антител в уравнении ниже. Предполагая, что Kd1 = Kd2 для двух паратопов антитела, это приведет к сопоставимым концентрациям свободного антитела и комплексов антитело-антиген в образце><.
Отрегулируйте концентрацию антител, чтобы общая концентрация белка в образце оставалась в диапазоне от 10 нМ до 50 нМ. Наилучшие результаты получены при использовании смесей с концентрацией антител от 5 нМ до 25 нМ.<бр/>
заметка: МП обнаруживает белки с молекулярной массой более 40 кДа. Следовательно, концентрации антигенов в образцах с молекулярной массой менее 40 кДа могут превышать типичный предел в 50 нМ. Однако при концентрациях, превышающих приблизительно 100 нМ, даже антигены с низкой молекулярной массой могут влиять на качество изображения и точность определения Kd.
- Приготовьте 50 мкл смеси антитело-антиген при ее окончательной мерной концентрации, рассчитанной на шаге 2.3.
заметка: Для определения Kd требуется только один образец смеси антиген-антитело. Тем не менее, подготовка нескольких образцов с разным соотношением антигенов и антител может помочь оптимизировать концентрацию образца. Если собраны данные из нескольких образцов, их можно проанализировать с помощью глобальной подгонки.
- Инкубируйте смесь антигенов и антител в течение приблизительно 10 минут при комнатной температуре, чтобы реакция связывания достигла химического равновесия. Избегайте излишне долгого времени инкубации.
заметка: Время инкубации может варьироваться в зависимости от кинетики связывания. Чтобы подтвердить, что химическое равновесие было достигнуто, измерения образцов могут быть повторены при разном времени инкубации. Инвариантные по времени значения Kd указывают на достаточно длительную инкубацию. Длительная инкубация может привести к значительной адсорбции белка на поверхности пластиковой лабораторной посуды и, как следствие, к существенным ошибкам в определении концентрации белка. По этой причине для подготовки образцов МП настоятельно рекомендуется использовать лабораторную посуду с низкой адгезией.
3. Сбор данных массовой фотометрии
- Нанесите каплю иммерсионного масла для микроскопа на объектив МП и поместите собранную проточную камеру на предметный столик микроскопа. Убедитесь, что масло охватывает зазор между покровным стеклом и объективом.
- Загрузите проточную камеру и сфокусируйте массовый фотометр.
- Внесите 10 μL чистого отфильтрованного буферного раствора на один конец канала проточной камеры, приготовленного на этапе 1. Жидкость будет поступать в канал за счет капиллярного действия.
- Отрегулируйте Z-образное положение предметного столика, чтобы сфокусировать микроскоп на рабочей поверхности покровного стекла размером 24 x 50 мм.
- На вкладке «Управление фокусировкой» программного обеспечения для сбора данных используйте кнопки «Вверх» и «Вниз» для грубого движения сцены для выполнения первоначальных настроек.
- Нажмите кнопку «Резкость», чтобы отобразить показания сигнала резкости, и используйте тонкие кнопки регулировки «Вверх» и «Вниз», чтобы максимизировать значение «Резкость».
- Нажмите кнопки «Установить фокус» и «Заблокировать фокус», чтобы активировать функцию слежения за фокусом. Правильно сфокусированное изображение (рис. 2A, C) должно иметь значение «сигнала» ниже 0,05%.
заметка: Если значение «сигнала» при положении максимальной резкости выше 0,05%, это может свидетельствовать о примесях на поверхности стекла или в буфере.
- Используя тот же канал, загрузите 20 мкл образца антитела-антигена, поместив его на одну сторону канала и промокнув жидкость с другого конца небольшим листом промокательной бумаги (рис. 1D).
заметка: Объем канала шириной 3–5 мм составляет примерно 10 мкл. Дополнительный объем пробы рекомендуется использовать для полной замены буфера, присутствующего в канале, и во избежание разбавления пробы.
- После загрузки образца сразу же нажмите кнопку «Запись», чтобы начать сбор данных, получая видео продолжительностью 100 секунд (рисунок 2D).
- В конце сбора данных введите имя файла и нажмите OK, чтобы сохранить файл данных.
- Выбросьте покровные стекла и сотрите масло с линзы объектива ватными оптическими тампонами, смоченными изопропанолом.
заметка: Протокол можно поставить на паузу здесь.
4. Анализируйте данные MP
- Обработайте собранный видеофайл с помощью программного обеспечения для обработки данных MP для идентификации событий посадки.
- Используйте опцию меню Файл/Открыть, чтобы загрузить файл для анализа, и нажмите Анализировать.
- Нажмите кнопку «Загрузить», чтобы загрузить функцию калибровки и сохранить проанализированные данные с помощью пункта меню «Файл/Сохранить результаты как».
- Подгонка распределения молекулярной массы с помощью гауссовых функций для получения относительных концентраций каждого вещества в образце. Этот анализ может быть выполнен с помощью обычного программного обеспечения для построения научных графиков (см. Таблицу материалов).
- Импортируйте файл "eventsFitted.csv" в программу и построите график распределения молекулярной массы (столбец M в файле .csv) с помощью функции График/Статистика/Гистограмма.
- Дважды щелкните гистограмму, чтобы открыть окно «Свойства графика». Отключите автоматическое группирование и выберите размер ячейки 2,5 кДа. Нажмите кнопки Применить и Перейти, чтобы создать данные Центры и подсчеты ячеек.
- Выберите столбцы «Центры бинов» и «Подсчеты» и используйте функцию меню «Анализ/Пики» и «Базовая линия/Аппроксимация нескольких пиков», чтобы подогнать гистограмму с помощью гауссовских функций. Дважды щелкните мышью, чтобы указать приблизительные положения пиков на графике распределения, а затем нажмите кнопку Открыть NLFit.
- Отметьте флажками Фиксированные для пиковых центров "xc" и установите их значения в соответствии с ожидаемыми молекулярными массами свободного антитела и комплексов один и двойной антиген-антитело. Отметьте параметры ширины в опции «Поделиться». Нажмите кнопку «По размеру». Подогнанные значения высоты пика гауссовых компонент представляют собой относительную концентрацию каждого вещества в образце.
заметка: Размер бункера может быть отрегулирован для оптимизации разрешения графика распределения массы. Предел точности MP составляет примерно 1 кДа, и меньшие размеры бункера могут усиливать шум распределения, не раскрывая при этом никакой дополнительной информации. Очень большие размеры бункеров скроют мелкие детали распределения массы.
- Рассчитайте долю концентрации каждого вещества с помощью следующего уравнения:
где значения hi и f i представляют собой пиковые высоты и доли концентрации свободного антитела и одно- и двухсвязанного антитела в образце, соответственно.
