1. Приготовление агарозной подушечки (Рисунок 1)
- Поместите предметное стекло микроскопа на ровную горизонтальную поверхность. Расположите две стеклянные горки, увенчанные двумя слоями клейкой ленты, с каждой стороны от начальной горки.
заметка: Соблюдайте расстояние 1-2 мм между тремя выровненными предметными стеклами, чтобы расплавленная агароза в конечном итоге не растекалась по предметным стеклам с помощью клейкой ленты.
- Пипеткой и налейте каплю 70 мкл 1% расплавленной агарозы на предметное стекло. Добавьте четвертую горку сверху, чтобы разгладить каплю агарозы, и слегка прижмите. Подождите около минуты.
- Снимите верхнее предметное стекло и капните с помощью пипетки около 3 л бактерий в 3-4 места в разных местах на агарозную подушечку.
- Крышка со стеклянным покровным стеклом для микроскопии (например, толщиной 22x22 мм #1,5).
заметка: Плоскостность и толщина покровных покрытий важны для работы с двухфотонными возбуждениями. Прецизионные покровные стекла с контролируемой равномерной плоскостностью и низкой автофлуоресценцией обычно являются хорошим выбором.
- Закрепите покровное стекло расплавленным парафином, чтобы прикрепить покровное стекло к предметному стеклу. Начните с фиксации четырех углов покровного стекла.
2. Визуализация с помощью двухфотонной микроскопии
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем самодельный двухфотонный сканирующий инвертированный микроскоп с возбуждением от двух фотонов и объективом погружения в воду 60x 1,2NA, работающий в режиме сбора флуоресценции без сканирования. Длина волны двухфотонного возбуждения установлена на 930 нм. Он обеспечивается титан-сапфировым лазером (частота следования 80 МГц, ≈ длительностью импульса 70 фс), работающим с мощностью 10-20 мВт. Флуоресцентные фотоны собирали через фильтр коротких частот 680 нм и полосовой фильтр 525/50 нм, прежде чем направлять их на фотодиод с волновой обвязкой, подключенный к модулю подсчета одиночных фотонов (TCSPC). Микроскоп также оснащен просвечивающей флуоресцентной лампой. В настоящее время в продаже имеется несколько микроскопов FLIM-FRET, и многие средства визуализации оснащены установками, способными выполнять измерения FLIM-FRET.
- С помощью люминесцентной лампы сфокусируйте объектив на монослое бактерий в образце и выберите интересующие области.
- Убедитесь, что затвор лазера возбуждения закрыт, а инфракрасный свет, поступающий от лазера, заблокирован и не попадает в микроскоп.
осторожность: При работе с ИК-импульсными лазерами следует проявлять тщательное внимание и постоянную бдительность, так как лазерный свет не виден глазам, но любое даже преходящее прямое воздействие или лазерное отражение может быть чрезвычайно вредным и привести к необратимому повреждению глаз. Пожалуйста, ознакомьтесь с местными процедурами безопасности лазера и обучением перед использованием установок для микроскопии.
- Поместите предметное стекло на предметное стекло на предметное стекло покровными стеклами к объективу.
- Убедитесь, что люминесцентная лампа включена.
- Поверните револьверную головку куба фильтра, чтобы выбрать куб eGFP, и откройте затвор люминесцентной лампы.
- Направьте флуоресцентный свет на окуляр микроскопа.
Внимание: Убедитесь, что на пути света расположены соответствующие фильтры, чтобы предотвратить прямое возбуждение, исходящее от флуоресцентной лампы, которое может повредить глаза.
- Сфокусируйте объектив на бактериях с помощью ручки микроскопа.
- Выберите интересующую область в образце, переместив ее с помощью джойстика, управляющего моторизованным столиком
заметка: Фокусировка при использовании образцов с высокой люминесцентностью упрощается, что позволяет видеть флуоресценцию непосредственно глазами.
- Переключите возбуждение лазера 2PE для измерений FLIM-FRET.
- Отправьте траекторию флуоресцентного излучения обратно к детектору.
- Поверните назад револьверную головку с фильтрующим кубом, чтобы выбрать дихроичный куб для лазера с длиной волны 930 нм.
- Установите мощность лазера на 20 мВт.
- Установите размер интересующей области на 30 мкм. Эта операция регулирует напряжение, приводящее в действие гальвозеркала, и определяет диапазон их перемещений (рисунок 2).
- Включите детектор и начните сканирование образца - кнопки запуска и остановки, управляющие сканированием, также контролируют открытие и закрытие лазерного затвора как в целях безопасности, так и для ограничения фотообесцвечивания образца (рис. 2).
- При необходимости отрегулируйте фокусировку, слегка переместив ручку тонкой фокусировки микроскопа.
- Выберите поле зрения для получения изображения, точно перемещая рабочую область из интерфейса компьютера. Это можно сделать на месте, переместив крестик на изображении в управляющем программном обеспечении микроскопа (рис. 2), которое определит новый центр изображения, и нажав кнопку «Переместить рабочую область». Хорошее поле зрения для съемки соответствует изображению с 10-30 неподвижными бактериями, все они правильно сфокусированы (все бактерии находятся в одной плоскости). Если вас интересует извлечение данных FLIM-FRET для отдельных клеток, убедитесь, что бактерии хорошо индивидуализированы (сегментация изображений будет намного проще).
