Анализ клеточной агрегации для выявления транс-взаимодействий между молекулами клеточной адгезии

Abstract

Источник: Restrepo, S., et al., Измерение трансцеллюлярных взаимодействий через агрегацию белков в гетерологичной клеточной системе. J. Vis. Exp. (2020)

В этом видео мы демонстрируем технику измерения трансклеточных взаимодействий между молекулами адгезии синаптических клеток с помощью анализа агрегации клеток HEK. В этом анализе равное количество HEK-клеток, экспрессирующих желаемую молекулу пресинаптической клеточной адгезии и флуоресцентный белок, смешивают с HEK-клетками, экспрессирующими постсинаптическую молекулу клеточной адгезии и другой флуоресцентный белок. Взаимодействие между молекулами клеточной адгезии заставляет клетки агрегировать, что можно измерить с помощью флуоресцентной микроскопии.

Protocol

1. Клеточная культура и трансфекция

1. Приготовьте клеточную среду HEK с DMEM, 1x (модификация Dulbecco's Eagle's Medium) с добавлением 4,5 г/л глюкозы, L-глутамина и пирувата натрия, а также 10% FBS. Стерильный фильтр.
2. Определение подходящих лигандов и рецепторов для агрегационного анализа.
   заметка: В этом исследовании использовали Neurexin3α SS4+/- и один из его известных лигандов, LRRTM2. Лиганды и рецепторы, представляющие интерес, экспрессировались из кДНК в pcDNA3.1. Сборка Gibson была использована для вставки Neurexin3α в pcDNA3.1. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Подготовьте HEK293T клетки.
   1. Выращивайте HEK293T клеток до слияния в одной колбе Т-75.
   2. После слияния используйте 2 мл трипсина и поместите в инкубатор при температуре 37 °C на 2 мин. Добавьте 6 мл среды HEK в колбу для ресуспендирования клеток и перенесите все 8 мл в коническую пробирку объемом 15 мл.
   3. Гранулируйте при 500 x g в течение 5 минут и ресуспендируйте в средах клеток HEK в общей сложности 8 мл.
   4. Подсчитайте ячейки и добавьте 735 000 клеток в каждую лунку 6-луночного планшета. Отрегулируйте итоговый объем до 2 мл для каждой лунки с помощью фильтрующих материалов ячейки HEK.
   5. Поместите в инкубатор с температурой 37 °C и дайте клеткам вырасти в течение ночи или до тех пор, пока они не достигнут 50-60% слияния.
4. Трансфектировать HEK293T клетки методом фосфата кальция.
   1. Трансфектируйте лунку-1 3 мкг представляющего интерес белка и совместно трансфектируйте 1 мкг флуоресцентного белка (3 мкг pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- и 1 мкг mCherry).
   2. Трансфектируйте хорошо-2, как на шаге 1.4.1, но с мутировавшим белком, представляющим интерес (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Трансфектируйте лунку-3 3 мкг представляющего интерес лиганда и совместно трансфектируйте 1 мкг другого флуоресцентного белка (3 мкг pcDNA3.1 LRRTM2 и 1 мкг GFP).
   4. Трансфектируйте лунки-4 и лунки-5 в качестве отрицательных контролей: лунку-4 с 1 мкг GFP и лунку-5 с 1 мкг мЧерри.
   5. Подготовьте еще одну пластину (как в пунктах 1.4.1-1.4.4), если требуются дополнительные условия или контроль (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      заметка: Эффективность трансфекции анализируют через 24 ч после трансфекции под эпифлуоресцентным микроскопом и количественно оценивают как количество клеток, экспрессирующих флуоресцентный белок, которым они были трансфицированы. Более рациональный подход включает трансфекцию HEK-клеток бицистронным вектором, кодирующим флуоресцентный белок и представляющий интерес лиганд, и настоятельно рекомендуется по сравнению с котрансфекцией. В данном исследовании альфа-нейрексины имеют концентрацию ~4,3 кб, а низкая интенсивность флуоресценции наблюдалась при использовании бицистронной системы, что потребовало ко-трансфекции.
5. Через 48 часов после трансфекции соберите клетки для агрегации.
   1. Промойте каждую лунку дважды PBS.
   2. Добавьте 1 мл 10 мМ ЭДТА в PBS в каждую лунку, чтобы мягко диссоциировать межклеточные взаимодействия, и инкубируйте планшет при 37 °C в течение 5 мин.<бр/> заметка: Трипсин не рекомендуется применять на этапе 1.5.b из-за потенциального протеолитического расщепления молекул адгезии в исследовании. Кроме того, после добавления ЭДТА протокол не может быть остановлен до его завершения, так как клетки теперь будут подвергаться воздействию условий окружающей среды.
   3. Осторожно постучите по планшету, чтобы отделить клетки, и соберите каждую лунку в отдельные конические пробирки объемом 15 мл.
   4. Центрифуга конических пробирок при плотности 500 x g и комнатной температуре в течение 5 минут.
6. Пока клетки гранулируются, подготовьте 6 инкубационных пробирок, пометив верхнюю часть каждой микроцентрифужной пробирки каждым условием.
   заметка: Каждая перестановка условий GFP и mCherry должна использоваться для охвата всех экспериментальных условий и надлежащего контроля. Например: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-—mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Сделайте дополнительные трубки для размещения дополнительных условий и органов управления.
7. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в 500 мкл среды HEK с 10 мМ CaCl₂ и 10 мМ MgCl₂, подогретых до 37 °C.
   заметка: Добавление CaCl₂ и MgCl₂ позволяет молекулам адгезии восстанавливать связывание и требуется только в том случае, если рассматриваемые партнеры по трансцеллюлярному взаимодействию нуждаются в двухвалентных катионах для адгезии.
8. Подсчитайте клетки в каждой конической пробирке объемом 15 мл с помощью гемоцитометра и поместите 200 000 клеток каждого состояния в соответствующую пробирку на шаге 1.6 для смеси 1:1 в общем объеме 500 мкл<бр/> заметка: Для подсчета и подсчета соответствующих сумм должно уйти всего 5 минут на каждое условие.
9. Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в медленном вращателе трубок.

2. Получение изображений

1. Оптимизируйте параметры сбора данных микроскопом для конкретных образцов. В этом примере изображения были получены на широкопольном микроскопе. Используйте 5-кратный воздушный объектив (NA: 0,15; WD: 20000 μm), чтобы получить достаточно большое поле для анализа.
2. Оцените исходную агрегацию сразу после смешивания двух состояний клеток HEK на шаге 1.8. Теперь это изображения «нулевого времени».
   1. Пипетируйте 40 мкл каждой смеси образца на заряженное предметное стекло микроскопа и получайте изображение под флуоресценцией в каналах 488 и 561.
   2. Получение трех различных полей зрения в одной плоскости фокусировки для каждой капли образца.
3. Получите окончательные изображения через 60 минут как изображение «время 60».
   1. Чтобы получить изображение смеси «время 60» после 60-минутной инкубации, возьмите еще 40 мкл образца каждого состояния из вращающихся пробирок и направьте каждый образец пипеткой на заряженное предметное стекло. Изображение, как в шаге 2.2.
      заметка: Агрегацию клеток следует проверять каждые 15 мин до тех пор, пока не произойдет насыщение. Сроки агрегации будут зависеть от тестируемых белков.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Одноразовые микропробирки объемом 5 мл с защелкивающимися крышками	ВВР	89000-028	Инкубация смешанной популяции HEK-клеток
Блок фильтрации скорого потока 1000 мл, мембрана 0,2 мкм aPES	Термо Фишер	567-0020	Стерилизация сред HEK
Центрифужные пробирки SpectraTube объемом 15 мл	Наука Уорда	470224-998	Заготовка HEK-клеток
6-луночные стерильные планшеты для культивирования тканей	ВВР	100062-892 (Английский	Культивирование клеток HEK
Хлорид кальция	сигма	223506-500Г	Трансфекция фосфата кальция, ресуспендия клеток HEK
Центрифуга - Sorvall Legend RT	Лабораторная продукция Kendro	75004377	Заготовка HEK-клеток
Клеточный инкубатор сСО2	Термо Сайентиал	HERACELL 150i	Инкубация HEK клеток во время роста
DMEM, 1x (модификация Дульбекко орлиной среды) с 4,5 г/л глюкозы, L-глутамина и пирувата натрия	Корнинг	10-013-СВ	Обслуживание ячеек HEK
Фосфатно-солевой буфер PBS от Dulbecco (1X)	Gibco	14190-144	Пассирование/забор HEK cell
Этилендиаминтетрауксусная кислота	сигма	ЭД-500Г	Заготовка HEK-клеток
Falcon Вентилируемые колбы для культуры, площадь роста 75 см2	Корнинг	9381М26	Культивирование клеток HEK
Фетальная бычья сыворотка	сигма	17Л184	Обслуживание ячеек HEK
HEK293T ячейки	АТКС		Модельная система
ИзображениеJ	НИЗ	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Анализ изображений
Гексагидрат хлорида магния	сигма	М9272-500Г	Ресуспендия ячеек HEK
Натрия фосфат двухосновной безводный	Биореагенты Фишера	БП332-500	Трансфекция фосфата кальция
Раствор трипсина 0,25% (1X)	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	SH30042.01	Прохождение HEK-клеток
Вращатель трубок			Инкубация смешанной популяции HEK-клеток
Предметные стекла для микроскопа UltraClear. Белый матовый, с положительным зарядом	Denville Scientific Inc.	М1021	Получение изображений
Широкоугольный микроскоп	Цейсс	Axio Vert 200М	Получение изображений