ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе используются штаммы C. elegans, в которых оба потенциальных взаимодействующих партнера помечены. Настоятельно рекомендуется использовать отрицательный контрольный штамм, при котором не ожидается, что один меченый белок будет взаимодействовать с другим меченым партнером-кандидатом на взаимодействие. В данном случае в качестве негативного контроля для оценки фона использовался только GFP, так как не ожидается, что DLC-1 будет взаимодействовать с GFP в черве. В качестве экспериментального штамма был использован GFP-меченный OMA-1, так как предварительные данные свидетельствуют о его взаимодействии с DLC-1. Штаммы нематод, коэкспрессирующие контрольные и тестовые белки с 3xFLAG-меченым DLC-1, упоминаются в этом тексте как 3xFLAG::D LC-1; GFP и 3xFLAG::D LC-1; OMA-1::GFP (штаммы доступны по запросу; более подробная информация в Таблице материалов) соответственно. Здесь используются теги 3xFLAG и GFP; однако другие метки могут быть заменены при условии, что их антитела совместимы с реагентами набора PLA.
1. Уход за животными
- Держите червей на пластинах питательной среды для нематод (NGM), которые засеяны штаммом OP50 E. coli, и поддерживайте при температуре 24 °C для оптимальной экспрессии GFP.
- Проходите взрослых червей каждые 2-3 дня для размножения червей и содержания их на хорошем питании.
2. Подготовка синхронной культуры
- Синхронизируйте червей, отбеливая тарелку с сытыми, гравидными гермафродитами. Протокол отбеливания описан в Porta-de-la-Riva et al. Дайте эмбрионам вылупиться на ночь в центрифужной пробирке при температуре 24 °C, вращая конец за концом в 10 мл минимального буфера M9 (M9). Это приведет к образованию культуры задержанных личинок L1.
- Инкубируйте пробирку с задержанными личинками стадии L1 на льду в течение 10 минут, затем долейте в пробирку ледяной 1x M9.
- Используйте центрифугу для гранулирования личинок при 600 x g в течение 5 минут при 4 °C. Тщательно отсасывайте надосадочную жидкость так, чтобы осталось только 1-2 мл надосадочной жидкости.
- Повторно суспендируйте гранулу личинок и с помощью микропипетки перенесите 2 мкл культуры взвешенных личинок на предметное стекло. Подсчитайте, сколько личинок присутствует, чтобы определить плотность культуры личинок, что поможет направить посев червей на шаге 2.5.
заметка: Плотность 10-15 личинок L1/1 мкл хорошо подходит для посева.
- С помощью микропипетки передают объем личиночной культуры, необходимый для посева примерно 100-120 личинок стадии L1 на пластину OP50 диаметром 60 мм. Например, засейте 10 мкл культуры личинок, которая имеет плотность 10 L1 личинок/1 мкл культуры.
заметка: Не превышайте объем 40 мкл для посева личинок, иначе избыток жидкости нарушит работу газона OP50. Если объем культуры превышает 40 мкл, повторить шаги 2,3-2,4 для дальнейшего уменьшения объема и увеличения плотности культивирования личинок.
- Выращивайте червей при температуре 24 °C. Записывайте время, когда L1 высеваются на пластине, и периодически проверяйте стадию развития, чтобы определить идеальное время для вскрытия><.
заметка: Через 52 ч после посева L1 черви, культивируемые при 24 °C, обычно находятся в стадии молодого взрослого особи, которая является идеальной стадией для вскрытия PLA, нацеленной на гонады. Тем не менее, фактическое время, в которое синхронизированные черви достигают молодой взрослой стадии, может варьироваться в зависимости от штамма и температуры инкубации.
3. Рассечение/экструзия гонад
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение для выдавливания гонады необходимо для успешной работы PLA, нацеленного на гонады. Этот подход также может высвобождать эмбрионы, которые также работают с использованием этого протокола для PLA (см. Обсуждение для получения дополнительной информации). После вскрытия отрицательный контрольный и экспериментальный образцы фиксируют и обрабатывают на PLAA вместе параллельно. Также предлагается подготовить дополнительный набор образцов с целью флуоресцентного коиммуноокрашивания для демонстрации паттернов экспрессии белковых партнеров, представляющих интерес.
- Соберите 30-40 молодых взрослых червей в стеклянную чашку для часов, содержащую 500 μл 1x M9 + левамизол (конечная концентрация 2,5 мМ). После сбора червей тщательно удалите и выбросьте большую часть среды, чтобы удалить бактерии, которые переносятся вместе с червями.
- Добавьте свежие 500 мкл 1x M9 + левамизол и с помощью пипетки аккуратно наберите и распределите среду, чтобы промыть червей. Осторожно удалите и выбросьте большую часть среды, чтобы очистить бактерии, которые переносятся вместе с червями.
- Повторите этот шаг 2-3 раза, пока все бактерии не будут удалены. После завершения промывки оставьте червей примерно в 100 μл среды, чтобы сохранить водный баланс.
заметка: Не позволяйте червям находиться в среде дольше 7 минут, так как это нарушит выдавливание половых желез во время вскрытия. Проводите промывки с помощью препарирующего микроскопа, чтобы контролировать удаление сред, чтобы не потерять червей.
- С помощью стеклянной или полиэтиленовой пипетки перенесите червей на предметное стекло микроскопа размером 25 мм x 75 мм, покрытое 0,001% поли-L-лизином (предметные стекла, используемые в этой процедуре, имеют эпоксидное покрытие по периметру, оставляя три рабочих пространства размером 14 мм x 14 мм каждое). Удалите излишки среды так, чтобы осталось примерно 10-15 μл среды.
- С помощью препарирующего микроскопа и с помощью двух игл калибра 261/2 поместите одну иглу поверх другой так, чтобы концы образовали пару ножниц. Используя иглы, ориентированные таким образом, разрежьте червей за глоткой, чтобы освободить зародышевые линии. Препарируйте всех червей в течение 5 минут.
заметка: Более подробно о том, как проводить вскрытие, можно прочитать в предыдущей публикации Жервезе и Арура.
- После того, как все черви будут препарированы, аккуратно поместите покровное стекло размером 22 мм x 40 мм на предметное стекло так, чтобы оно было перпендикулярно предметному стеклу. Концы покровного стекла должны свисать с предметного стекла.
- Заморозьте предметные стекла на предварительно охлажденном алюминиевом блоке, хранящемся на сухом льду не менее 20 минут. Аккуратно положите охлажденный карандаш поверх покровного стекла, чтобы предотвратить ослабление покровного стекла из-за расширения льда.
4. Фиксация/блокировка
Когда предметное - стекло будет готово к фиксации, смахните покровные стекла карандашом или другим тупым инструментом и немедленно опустите предметное стекло в банку со свежим ледяным метанолом (охлажденным до -20 °C) на 1 минуту.
- Аккуратно протрите края предметного стекла, окружающие образец, чтобы следующий реагент удерживался поверхностным натяжением вокруг образца. Нанести 150 мкл фиксатора (2% формальдегида в 100 мМ KH2PO4, pH = 7,2) в течение 5 мин RT.
заметка: Мы также протестировали процедуру фиксации метанола/ацетона и обнаружили, что она совместима с реакцией PLA.
- Прикоснитесь предметным стеклом к бумажному полотенцу под углом 90°, чтобы фиксатор стекал со предметного стекла и впитывался в бумажное полотенце. Сгруппируйте предметные стекла 2 раза в течение 15 минут при РТ в банке Coplin с 50 мл 1x PBS/1% Triton X-100/1% бычьего сывороточного альбумина (PBT/BSA).
заметка: Для этого этапа блокировки и этапов мытья ниже приведены в разделах 6-9 для банок с коплином или других типов банок для окрашивания. Они обеспечивают достаточные объемы для эффективной замены блокирующего или промывочного буфера с образцом.
- Заблокируйте предметные стекла раствором PBT/BSA, содержащим 10% обычной козьей сыворотки. Аккуратно протрите края предметного стекла и нанесите на предметное стекло 100 мкл раствора. Инкубировать в течение 1 ч при РТ во влажной камере.
заметка: Этот этап настоятельно рекомендуется для окрашивания первичным антителом αFLAG. Влажная камера сконструирована путем закрепления стеклянных пипеток лентой в лотке, на которые слайды могут лежать во время инкубации. Смоченные рабочие салфетки (Table of Materials) помещаются в лоток для повышения внутренней влажности лотка и предотвращения испарения. Крышка и лоток покрыты фольгой для защиты образцов от света во время светочувствительных этапов.
- Положите предметное стекло на бумажное полотенце, чтобы раствор PBT/BSA/10%NGS стекал со предметного стекла, и аккуратно протрите края предметного стекла. Используйте блокирующий реагент (Table of Materials) для блокировки предметных стекол. Нанесите одну каплю на пространство 14 мм x 14 мм. Инкубируйте предметные стекла в течение 1 ч при температуре 37 °C во влажной камере.
5. Первичная инкубация антител
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения наилучших результатов PLA и минимального фона, фактор разбавления первичных антител может потребовать оптимизации (подробнее см. Обсуждение). Кроме того, первичные антитела должны быть выращены в разных хозяевах, которые соответствуют специфичности вторичных антител, используемых для PLA.
- Положите предметное стекло на бумажное полотенце, чтобы блокирующий реагент стекал со предметного стекла, и аккуратно протрите края. Используйте разбавитель антител (Таблица материалов) для разбавления первичных антител. Внесите 40 мкл раствора первичного антитела на пространство размером 14 мм x 14 мм.
- Инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение ночи при температуре 4 °C.
6. Инкубация зонда PLA (вторичного антитела)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для шагов 6-9 используйте буферы промывки A и B в RT. Если буферы хранятся при температуре 4 °C, дайте им нагреться до температуры RT перед использованием.
- Промойте предметные стекла 2 раза в течение 5 минут 50 мл 1x буфера для промывки A (Таблица материалов) при RT в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный вибратор, установленный на 60 оборотов в минуту.
- Положите слайд на бумажное полотенце, чтобы буфер для стирки стекал с предметного стекла, и аккуратно протрите края. Приготовьте раствор объемом 40 мкл, содержащий зонды PLUS и MINUS (разбавленные 1:5 разбавителем антител). Нанесите раствор на каждое пространство размером 14 мм x 14 мм.
- Инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 1 ч при температуре 37 °C.
7. Лигирование
- Промойте предметные стекла 2 раза в течение 5 минут с 50 мл 1 буфера для стирки A при RT в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный вибратор, установленный на 60 оборотов в минуту.
- Разбавьте буфер для лигирования (Таблица материалов) в соотношении 1:5 с ультрачистой водой. Используйте этот буфер для разбавления лигазы (Таблица материалов) в соотношении 1:40 для приготовления рабочего запаса раствора для лигирования.
- Положите предметное стекло на бумажное полотенце, чтобы буфер для стирки стекал с предметного стекла, и аккуратно протрите края. Нанесите 40 мкл раствора для лигирования на каждое пространство размером 14 мм x 14 мм.
- Инкубировать предметные стекла во влажной камере в течение 30 минут при температуре 37 °C.
8. Усиление
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование реагентов для обнаружения с красными флуорофорами (Таблица материалов) приводит к наименьшему количеству фона в тканях C. elegans.
- Промойте предметные стекла 2 раза в течение 5 минут с 50 мл 1 буфера для стирки A при RT в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный вибратор, установленный на 60 оборотов в минуту.
- Разбавьте амплификационный красный буфер (Таблица материалов) 1:5 со сверхчистой водой. С помощью этого буфера разбавляют полимеразу (Таблица материалов) в соотношении 1:80 для приготовления рабочего запаса амплификационного раствора и защиты от света.
- Положите предметное стекло на бумажное полотенце, чтобы буфер для стирки стекал с предметного стекла, и аккуратно протрите края. Нанесите 40 мкл раствора для усиления на каждое пространство размером 14 мм x 14 мм.
- Инкубируйте предметные стекла во влажной камере в течение 1 ч 40 мин при температуре 37 °C. Убедитесь, что влажная камера накрыта пленкой для защиты образцов от света.
9. Окончательные промывки
- Промойте предметные стекла 2 раза в течение 10 минут с 50 мл 1x буфера для промывки B (Таблица материалов) по RT в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный вибратор, установленный на 60 оборотов в минуту.
- Промойте предметные стекла 1x в течение 1 минуты 50 мл 0,01x буфера для промывки B при RT в банке Coplin. Установите банку Coplin на орбитальный вибратор, установленный на 60 оборотов в минуту. Этот буфер готовится путем разбавления промывочного буфера В сверхчистой водой.
10. Монтаж покровного стекла
- Дайте излишкам буфера для стирки стечь стекающее стекло на бумажное полотенце и сотрите остатки буфера, оставшегося по периметру предметного стекла с эпоксидным покрытием.
- Добавьте 10 μL монтажного материала (Таблица материалов) к образцу и аккуратно положите сверху покровное стекло, позволяя монтажному материалу разрастись.
- Покрасьте край покровного стекла лаком для ногтей, чтобы запечатать покровное стекло и горку. Будьте осторожны с нанесением лака для ногтей, чтобы избежать смещения покровного стекла, которое может повредить зародышевые линии. Дайте лаку для ногтей застыть не менее 20 минут при температурной терапии, в то время как предметные стекла защищены от света, прежде чем рассматривать их под микроскопом.
