1. Иммунопреципитация
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали буфер для лизиса додецилсульфата натрия (SDS) и элюирование цитрата, как описано в следующих разделах. Тем не менее, использование альтернативного метода иммунопреципитации на предприятии также может быть применимо для подготовки образцов ЖХ-МС/МС.
- Трансфектируйте культивируемые клетки векторами, кодирующими только эпитопную метку или гибридный белок. Для получения репрезентативных данных переносите клетки J774 (1 x 106) с векторами, кодирующими только зеленый флуоресцентный белок (GFP) или GFP-слитый Capn6 (ген кальпаина-6) с использованием катионных липосом.
- Конъюгированное антитело к магнитным шарикам.
- Для этого смешайте антитела против GFP (2 мкл/реакция) с магнитными шариками (25 мкл/реакция) в 500 мкл цитратфосфатного буфера (24,5 мМ лимонной кислоты, 51,7 мМ двухосновного фосфата натрия; pH 5,0) в пробирке объемом 1,5 мкл.
- Вращайте смесь со скоростью 50 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем сопряженные с IgG шарики трижды промывают цитратфосфатным буфером, содержащим 0,1% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата.
- Лизируйте трансфицированные клетки с помощью соответствующего буфера для лизиса. Для получения репрезентативных данных необходимо лизировать трансфицированные клетки в течение 30 мин на льду в 400 мкл лизисного буфера (50 мМ Tris-HCl; pH 7,5, 120 мМ NaCl, 0,5% поли(оксиэтелен)октилфенилового эфира), содержащего 40 мкмоль/л фенилметилсульфонилфторида, 50 мкг/мл лейпептина, 50 мкг/мл апротинина, 200 мкмоль/л ортованадата натрия, и 1 мМ этиленгликоля тетрауксусной кислоты (ЭГТА) в пробирках объемом 1,5 мл через 24 ч после трансфекции.
- Очистите лизат центрифугированием при 15 000 x g в течение 5 минут и соберите надосадочную жидкость.
- Предварительно очистите лизат. Добавьте немаркированные магнитные шарики (25 мкл/реакция) в пробирку объемом 1,5 мл. Промойте шарики три раза 500 μл цитратфосфатного буфера. После удаления цитратфосфатного буфера в окончательной промывке добавьте лизат клеток поверх магнитных шариков. Вращайте смесь с помощью вращателя со скоростью 50 об/мин в течение 30 минут при комнатной температуре.
- Поместите пробирку на магнитную подставку на 5 минут для магнитной сепарации, и соберите лизат клеток. Рекомендуется использовать магнитную стойку, обозначенную производителем.
- Свяжите целевые белки с конъюгированными шариками. Поместите конъюгированные с иммуноглобулином (Ig)G-шариками на магнитную подставку на 5 минут для магнитного разделения, выбросьте цитратный буфер, а затем добавьте лизат клеток к разделенным шарикам.
- Вращайте смесь со скоростью 50 об/мин в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Отделите целевые белки от свободных нецелевых белков. Промойте шарики три раза, используя 500 мкл цитратфосфатного буфера, содержащего 0,1% полиоксиэтилена (20) сорбитана монолаурата. После окончательной промывки добавьте 30 μL цитратного буфера (pH 2–3) и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы элюировать целевые белки.
заметка: Если восстановление после иммунопреципитации недостаточно, использование альтернативных эпитопных меток, таких как FLAG или HIS, может повысить эффективность. Если эффективность элюирования недостаточна, использование других элюантов, таких как раствор на основе SDS, может повысить эффективность.
2. Переваривание белков на мембране
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование материалов и оборудования, не содержащих белок, необходимо, чтобы избежать загрязнения экзогенными белками. Кроме того, оператору рекомендуется носить хирургическую маску и перчатки во избежание загрязнения человеческими белками.
- Разрежьте мембраны PVDF на кусочки размером 3 мм x 3 мм хирургическими ножницами, протертыми метанолом и высушенными непосредственно перед использованием.
- Добавьте 2–5 μл этанола к кусочкам мембраны из ПВДФ на чистой алюминиевой фольге.
- Прежде чем они полностью высохнут, добавьте элюант (2–5 μл каждая, 4–6 штук на образец) на гидрофильные мембраны из PVDF, а затем высушите мембраны на воздухе, пока поверхность мембраны не станет матовой. Высушенные мембраны можно хранить при температуре 4 °C.
- Переложите все мембраны в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл, добавьте 20–30 мкл этанола, чтобы сделать мембраны гидрофильными, а затем удалите этанол с помощью пипетки.
- До полного высыхания мембраны добавьте 200 μL реакционного раствора на основе дитиотреитола (DTT) (80 мМ NH4HCO3, 10 мМ DTT и 20% ацетонитрила) и инкубируйте при 56 °C в течение 1 ч.
- Замените реакционный раствор 300 мкл раствора йодоацетамида (80 мМ NH4HCO3, 55 мМ йодоацетамида и 20% ацетонитрила) и инкубируйте в течение 45 мин при комнатной температуре в темноте.
- Дважды промыть мембраны 1 мл дистиллированной воды и один раз 1 мл 2% ацетонитрила путем вихревого перемешивания в течение >10 с.
- Растворите лиофилизированный трипсин MS-класса (Таблица материалов) непосредственно в реакционном растворе (30 мМ NH4HCO3, содержащем 70% ацетонитрила). Добавьте 100 мкл реакционного раствора, содержащего 1 мкг трипсина (Таблица материалов) (30 мМ NH4HCO3, содержащий 70% ацетонитрила) и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
- Переведите реакционный раствор, содержащий триптические расщепления, в чистую пробирку объемом 1,5 мл с помощью пипетки.
- Добавьте 100 μл промывочного раствора (70% ацетонитрила/1% трифторуксусной кислоты) к мембране и инкубируйте при 60 °C в течение 2 ч. Соберите промывочный раствор и смешайте его с реакционным раствором. Добавьте к мембране еще 100 μл моющего раствора и обрабатывайте его ультразвуком в течение 10 минут. Затем соберите раствор для промывки и смешайте его с реакционным раствором.
- Накройте пробирку кусочком лабораторной пленки и проделайте иголкой пару небольших отверстий. Высушите раствор с помощью вакуумного концентратора.
- Растворите остаток в 10 мкл 0,2% муравьиной кислоты. После центрифугирования (12 000 × г, 3 мин при комнатной температуре) перенесите надосадочную жидкость в пробирку для образца.
заметка: Промывка является важнейшим этапом этого раздела. Во время внутримембранного расщепления белков промывание мембран, содержащих иммобилизованные белки, после восстановления и алкилирования дистиллированной водой с последующим добавлением 2% ацетонитрила в течение более 10 секунд имеет решающее значение для удаления реагентов.
