$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Гидратация биосенсора и настройка анализа
- Включите аппарат BLItz.
- Убедитесь, что аппарат подключен к компьютеру через USB-порт вывода данных на задней панели аппарата.
- На компьютере откройте соответствующее программное обеспечение (например, BLItz Pro) и нажмите «Расширенная кинетика» в левой части экрана.
- В программном обеспечении введите всю необходимую информацию об эксперименте (включая название эксперимента, описание, идентификатор образца и концентрацию белка) под каждым соответствующим заголовком.
- Нажмите «Тип биосенсора» и выберите Ni-NTA в раскрывающемся меню.
- Под заголовком Run Settings убедитесь, что для шейкера установлено значение Enable.
- Под заголовком Список типов шагов убедитесь, что в списке указано 5 элементов: Начальный базовый план, Загрузка, Базовый уровень, Ассоциация и Диссоциация.
заметка: Продолжительность каждого шага может быть изменена по умолчанию по мере необходимости. Для получения оптимальных результатов используйте минимум 30 с для параметров Начальная базовая линия и Базовая линия; и 120 секунд за ассоциацию и диссоциацию. Продолжительность этапа нагружения (от 120 до 240 с) будет зависеть от концентрации лиганда и сродства метки His-эпитопа на лиганде к Ni-NTA-биосенсору.
- Извлеките гидратированный биосенсор Ni-NTA из ПЦР-пробирки и прикрепите его к креплению биосенсора на машине, сдвинув широкую часть биосенсора на крепление.
заметка: Не допускайте пересыхания биосенсора во время эксперимента.
- Поместите черную микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 мл в держатель пробирки аппарата и нанесите в нее 400 мкл буфера LI.
- Убедитесь, что ползунок устройства расположен таким образом, что держатель пробирки находится перед черной стрелкой на аппарате.
- Закройте крышку аппарата так, чтобы наконечник биосенсора погрузился в буфер в микроцентрифужной пробирке.
- Нажмите кнопку «Далее» в программном обеспечении, чтобы начать запись исходного базового уровня.
2. Загрузка лиганда на биосенсор
- После завершения записи на этапе Начальная базовая линия откройте крышку устройства.
- Переместите ползунок вправо так, чтобы держатель капли (вместо держателя трубки) находился перед черной стрелкой.
- Нанесите пипетку объемом 4 мкл диализованного лиганда, помеченного His, на держатель и закройте крышку аппарата.
Примечание: Оптимальная концентрация используемого лиганда может варьироваться для каждого белка. Концентрация от 1,0 до 2,0 мг/мл обычно достаточна для насыщения NTA на кончике биосенсора за 240 с.
- В программном обеспечении нажмите «Далее», чтобы начать загрузку.
3. Смывание дополнительного лиганда
- После завершения записи на этапе загрузки откройте крышку устройства.
- Переместите ползунок влево так, чтобы держатель пробирки снова оказался перед черной стрелкой.
- Закройте крышку аппарата и убедитесь, что наконечник биосенсора погружен в буфер BLI пробирки в держателе пробирки.
- Нажмите «Далее» еще раз в программном обеспечении, чтобы начать запись базового плана.
4. Ассоциация аналита с лигандом
- После того как на этапе Baseline (Базовый уровень) будет завершена запись, откройте крышку устройства.
- Снимите держатель капель и очистите его, отпив все белки и промыв его дважды деионизированной водой (ddH2O) в общей сложности 5 раз.
- Используйте салфетку для очистки поверхности держателя капель после стирки.
- Установите откидной держатель обратно на устройство.
- Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель сбрасывателя снова оказался перед черной стрелкой.
- Нанесите 4 мкл диализованного аналита на держатель и закройте крышку аппарата.
- В программном обеспечении нажмите кнопку Далее, чтобы начать ассоциацию.
5. Диссоциация аналита из лиганда
- После того как на этапе Ассоциативный элемент завершит запись, откройте крышку аппарата.
- Переместите ползунок на аппарате вправо так, чтобы держатель трубки снова оказался перед черной стрелкой.
- В программном обеспечении нажмите кнопку «Далее», чтобы начать диссоциацию.
- После завершения записи на этапе диссоциации откройте крышку устройства.
- Снимите держатель капли и держатель трубки.
- Тщательно промойте оба с ddH2O, чтобы смыть белок.
- Извлеките биосенсор и безопасно утилизируйте его.