$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Подготовка образцов: анализ межклеточного смешивания
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол описывает процедуру смешивания адгезивных клеток. Он может быть модифицирован для клеток, культивируемых в суспензии.
- Засейте соответствующее количество клеток на 6-луночный планшет, например, 800 000 клеток HEK 293T (подсчитанных с помощью счетной камеры Нейбауэра), за день до трансфекции. Число может быть изменено в зависимости от времени между посевом и трансфекцией и скорректировано для других типов клеток. Для проведения базового эксперимента (т.е. белков, представляющих интерес и отрицательный контроль), подготовьте не менее 4 лунок. Культивирование клеток при 37 °C, 5%CO2 в среде Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением фетальной бычьей сыворотки (10%) и L-глутамина (1%).
- Трансфектируйте клетки в соответствии с инструкцией производителя (см. Таблицу материалов).
- Чтобы провести базовый эксперимент, трансфектируйте в отдельные лунки плазмиды для представляющего интерес белка, слитые с «зеленым» (например, мономерным усиленным зеленым флуоресцентным белком (mEGFP) или желтым флуоресцентным белком (mEYFP)) или «красным» (например, mCherry или mCardinal) флуоресцентным белком><.
заметка: В этом протоколе мы фокусируемся на APLP1-mEYFP и APLP1-mCardinal и соответствующем отрицательном контроле, например, миристоилированном-пальмитированном-mEYFP (myr-palm-mEYFP) и -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Как правило, достаточно 200 нг - 1 мкг плазмидной ДНК. Высокая эффективность трансфекции увеличивает вероятность обнаружения «красных» и «зеленых» клеток в контакте. Измените количество плазмиды и реагента для трансфекции для оптимизации эффективности трансфекции. критический: Конфлюенция клеток должна составлять около 70% при трансфекции клеток. Если клетки чрезмерно сливаются, эффективность трансфекции снижается. Если клетки недостаточно сливаются, трансфекция и смешивание могут вызвать стресс и помешать правильному прикреплению многих клеток после смешивания.
- Перемешивание клеток выполнить через ~4 ± через 2 ч после трансфекции.
- Удалите питательную среду и аккуратно промойте каждую лунку 1 мл PBS с добавлением Mg2+ и Ca2+. Затем снимите PBS. (Критический) Капните PBS на край колодца, чтобы предотвратить отслоение ячеек во время промывки.
- Добавьте ~50 мкл раствора трипсина этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) по каплям в каждую лунку, чтобы облегчить отслоение клеток. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 2 минут. После этого медленно встряхните 6-луночный планшет в сторону, чтобы отделить клетки.
заметка: Для некоторых типов клеток может потребоваться увеличенное время инкубации.
- Добавьте 950 мкл питательной среды в каждую лунку и повторно суспендируйте клетки путем пипетирования несколько раз вверх и вниз, тем самым отделив все клетки от дна лунки. (Критический) Убедитесь, что клетки правильно ресуспендированы и отделены друг от друга, визуально проверив отсутствие крупных клеточных агрегатов после ресуспензии. В противном случае после смешивания будет получено много 'красных'-красных' или 'зеленых'-зеленых' контактов.
- Перенесите клеточный раствор из одной лунки (представляющий интерес белок или отрицательный контроль) в соответствующую лунку, т.е. из «красных» (например, трансфицированных APLP1-mCardinal) в «зеленые» (например, трансфицированные APLP1-mEYFP) клетки. Перемешайте, осторожно пипетируя несколько раз вверх и вниз. Затем засейте смешанные клетки на стеклянных чашках со стеклянным дном диаметром 35 мм (1 мл раствора смешанных клеток на чашку плюс 1 мл питательной среды) и культивируйте засеянные клетки в течение следующих суток при 37 °C, 5%CO2.
2. Подготовка образцов: положительный контроль для экспериментов с перекрестной корреляцией и конструкция гомо-димера для анализа яркости
- Засейте 600 000 клеток HEK 293T, подсчитанных с помощью камеры для подсчета клеток, на стеклянных тарелках диаметром 35 мм за день до трансфекции. Культивируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 в полной среде DMEM (см. шаг 1.1) в течение следующего дня.
- Трансфектируйте клетки с ~250 нг плазмидной ДНК в соответствии с инструкциями производителя. Для контроля положительной взаимной корреляции используйте плазмиду, кодирующую мембранно-закрепленный флуоресцентный белок гетер-димер, например, myr-palm-mCherry-mEGFP или myr-palm-mCardinal-mEYFP, соответствующие FP интересующего белка. Для калибровки яркости используйте плазмиды, кодирующие как мембранно-закрепленный мономер FP, так и гомо-димер, соответствующий FP, слитым с интересующим белком, например, myr-palm-mEYFP и myr-palm-mEYFP-mEYFP для калибровки анализа яркости APLP1-mEYFP.
- Культивируйте клетки при 37 °C, 5%CO2 в полной среде DMEM (см. шаг 1.1) в течение следующих суток.
3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия: настройка и калибровка фокусного объема
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол написан для экспериментов, выполненных с mEGFP/mEYFP и mCherry/mCardinal на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе, используемом в этом исследовании. Оптическая установка, настройки программного обеспечения (лазерные линии, дихроичные зеркала, фильтры) и выбор калибровочных красителей могут быть изменены для других FP и микроскопов.
- Включите микроскоп и лазеры не менее чем за час до эксперимента, чтобы убедиться в стабильности лазера и уравновешивании температуры.
- Приготовьте 100-200 мкл подходящих водорастворимых растворов флуоресцентных красителей (см. примеры в таблице материалов) в воде или PBS для калибровки фокусного объема с концентрациями в диапазоне 10-50 нМ.
- Растворы красителей поместить на чистую стеклянную чашку со стеклянным дном диаметром 35 мм #1,5, т.е. толщиной 0,16-0,19 мм.<бр/>
заметка: В идеале следует использовать посуду с высокоэффективным защитным стеклом с низким допуском по толщине, например, 0,170 ± 0,005 мм, что позволяет оптимально скорректировать кольцо воротника (шаг 3.6). Важно использовать тот же тип посуды, который использовался позже для следующих экспериментов.
- Поместите чашку с раствором красителя непосредственно на объектив (предпочтительно с погружением в воду, с NA 1.2), чтобы обеспечить фокусировку в растворе. В качестве альтернативы поместите чашку на держатель для образцов и сфокусируйтесь на образце (например, на высоте 10-20 мкм над дном чашки).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы не рекомендуем использовать масляные объективы из-за плохого сигнала, получаемого при фокусировке вглубь водных образцов.
- Настройте путь возбуждения и излучения, например, выберите лазер с длиной волны 488 нм, дихроичное зеркало с длиной волны 488/561 нм, окно обнаружения 499-552 нм и размер отверстия 1 единица Эйри (AU). Убедитесь, что размер точечного отверстия совпадает с тем, который будет использоваться при измерениях взаимной корреляции.
- Отрегулируйте положение отверстия (регулировка отверстия) и кольцо воротника объектива, чтобы максимизировать скорость счета. Для этой цели поворачивайте кольцо воротника до тех пор, пока не будет определена максимальная скорость счета.
заметка: Коррекция кольца воротника учитывает конкретную толщину используемого покровного стекла. Максимизация скорости счета, т.е. сбор как можно большего количества фотонов на молекулу, имеет решающее значение для максимизации отношения сигнал/шум (SNR) измерений.
- Выполните серию точечных измерений FCS (например, 6 измерений в разных местах, каждое из которых состоит из 15 повторений по 10 с, т. е. общее время 2,5 мин, при выборке с временем выдержки 1 мкс или менее) при той же мощности лазера, что и при измерениях с взаимной корреляцией (обычно ~1%, т. е. ~1-2 мкВт).
- Подгонка трехмерной модели диффузии, включающей триплетный вклад (уравнение 1) к данным.
заметка: Как правило, получаемое время диффузии составляет около 30 μс, а структурный фактор — около 4-8.
- Рассчитайте талию w0 на основе измеренного среднего времени диффузии и опубликованных значений коэффициента диффузии используемого красителя при комнатной температуре в соответствии с уравнением 2,
Типичные значения составляют 200-250 нм.
- Повторите процедуру калибровки (шаги 3.4-3.9) с другим флуоресцентным красителем для второго канала детектирования, если это необходимо (например, возбуждение 561 нм и детектирование между 570 нм и 695 нм). Оставьте положение и размер отверстия в том виде, в котором они были установлены для первого канала обнаружения.
- Рассчитайте молекулярную яркость (уравнение 3) по результатам калибровочных измерений, и сохраните полученные значения.
заметка: Типичные значения для используемой установки составляют ~8-10 кГц/молекула (МОЛЬ) при мощности возбуждения 1,8 мкВт 488 нм. Более низкие, чем обычно, значения могут указывать на загрязнение объектива, смещение настройки или снижение мощности лазера. Регулярно проверяйте и сохраняйте выходную мощность лазера на объективе с помощью измерителя мощности. Для сравнения различных установок молекулярная яркость, нормированная мощностью возбуждающего лазера, является наиболее значимым параметром для оценки производительности микроскопа.
4. Сканирующая флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия: сбор данных
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол написан для экспериментов, выполненных с mEGFP/mEYFP ("зеленым") и mCherry/mCardinal ("красным") на лазерном сканирующем конфокальном микроскопе, используемом в этом исследовании. Оптическая установка и настройки программного обеспечения (лазерные линии, дихроичные зеркала, фильтры) могут отличаться для других FP или микроскопов.
- Настройте оптический тракт, например, возбуждение 488 нм и 561 нм и дихроичное зеркало 488/561 нм, отверстие на 1 а.е. для возбуждения 488 нм. Чтобы избежать спектральных перекрестных помех, последовательно выберите две отдельные дорожки для возбуждения и детектирования mEGFP/mEYFP (возбуждение 488 нм, зеленый канал) и mCherry/mCardinal (возбуждение 561 нм, красный канал) и выберите треки коммутации каждой строки. Для обнаружения используйте соответствующие фильтры для обоих каналов, например, 499-552 нм в зеленом канале и 570-695 нм в красном канале.
- Если переменное возбуждение невозможно, используйте соответствующие настройки фильтра для красного канала, чтобы свести к минимуму спектральные перекрестные помехи (т.е. обнаружить mCherry/mCardinal флуоресценцию не ниже 600 нм). Это может уменьшить количество фотонов, обнаруживаемых в красном канале, и, таким образом, уменьшить отношение сигнал/шум.
- Поместите чашку со смешанными клетками на держатель для образцов. Подождите не менее 10 минут, чтобы обеспечить температурное равновесие и уменьшить смещение фокуса.
- Сфокусируйтесь на клетках с помощью индикатора пропускания в меню «Найти».
- Найдите пару «красных» и «зеленых» клеток, соприкасающихся друг с другом. Для положительной взаимной корреляции или управления яркостью гомо-димера (см. раздел 2) выполните поиск изолированной ячейки, излучающей флуоресценцию в обоих каналах, или соответствующего сигнала гомо-димера в PM.
ПРИМЕЧАНИЕ: (Критически) Сведите к минимуму воздействие образца во время поиска клеток, чтобы избежать предварительного обесцвечивания, которое может уменьшить взаимную корреляцию. Таким образом, сканируйте с максимальной скоростью сканирования и с низкой мощностью лазера. Чтобы избежать насыщения детектора при визуализации сильно экспрессирующих клеток, выполните поиск в режиме интегрирования. Однако для минимизации экспозиции возможно сканирование при более низких мощностях лазера в режиме подсчета фотонов.
- Выберите траекторию сканирования перпендикулярно контакту между клетками (или PM одной ячейки для положительной взаимной корреляции или контроля яркости гомо-димера) с помощью кнопки «Кадрировать», как показано на рисунках 1B и 2A.
заметка: Некоторые старые микроскопы не допускают произвольных направлений сканирования. В этом случае должны быть расположены межклеточные контакты с ориентацией, перпендикулярной направлению сканирования.
- Увеличьте масштаб, чтобы достичь размера пикселя 50-200 нм, и выберите «Линия» в режиме сканирования. Установите размер кадра на 128 × 1 пиксель.
заметка: Типичный размер пикселя составляет 160 нм, что соответствует длине сканирования около 20 мкм.
- Установите Скорость сканирования на максимально допустимое значение, например, 472,73 μс на строку.
заметка: Для альтернативной схемы возбуждения это соответствует времени сканирования 954,45 мкс, т.е. ~1000 сканирований/с на используемой установке. Скорость сканирования может быть скорректирована в зависимости от коэффициента диффузии интересующего белка. Для мембранно-закрепленных белков типичное время диффузии составляет около 10-20 мс. Время сканирования должно быть как минимум в десять раз меньше, чем время диффузии. Более низкая скорость сканирования может вызвать более сильное фотообесцвечивание и потребовать более низкой мощности освещения. В качестве альтернативы можно установить паузу, например, 5 мс, между каждым сканированием для очень медленно диффундирующих комплексов с помощью параметра «Интервал» в подменю «Временные ряды».
- Выберите подходящую мощность лазера, например, ~1-2 μВт для 488 нм и ~5-10 μВт для возбуждения 561 нм.
заметка: Более высокая мощность лазера улучшает отношение сигнал/шум, но увеличивает фотообесцвечивание. Поэтому мощности лазера следует выбирать таким образом, чтобы фотообесцвечивание составляло менее 50% от первоначальной скорости подсчета.
- Установите циклы на 100 000-500 000,< руб./>
заметка: Количество сканирований, т.е. продолжительность измерения, может варьироваться: более длительное время измерения улучшит отношение сигнал/шум и может быть более подходящим для медленно диффундирующих молекул, однако движение клеток и фотообесцвечивание ограничивают максимальное время измерения. Данные, представленные здесь, обычно собирались в течение ~3-6 минут, т.е. 200 000-400 000 сканирований строк.
- Установите детекторы в режим подсчета фотонов. Нажмите кнопку Start Experiment, чтобы начать сбор данных. Повторите шаги 4.5-4.11, чтобы измерить еще одну ячейку.
заметка: Рекомендуется измерять 10-15 клеток в одном образце при разных уровнях экспрессии. (Критический) Избегайте насыщения детектора при высоких уровнях сцеживания. Максимальная скорость подсчета не должна превышать ~1 МГц.
- Если для определения олигомерных состояний проводится яркостный анализ, то калибровочные измерения яркости гомо-димера проводят в соответствии с модифицированными шагами 4.1-4.11: Измеряют каждый гомо-димер флуоресцентного белка отдельно (в изолированных клетках, подготовленных с использованием раздела 2 протокола) и выполняют измерения только в одном спектральном канале.
