Иммунопреципитация для изучения взаимодействия ферментных рецепторов в трансфицированных клетках

Аннотация

Источник: Strazza, M., et al. ко-иммунопреципитационный анализ для изучения функциональных взаимодействий между рецепторами и ферментами. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео мы демонстрируем метод проведения ко-иммунопреципитации GFP-меченых белков дикого типа и мутировавших белков PD-1 с использованием гранул, покрытых антителами против GFP. Связанные с гранулами белки PD-1-GFP инкубируются с белками SHP2, которые взаимодействуют с PD-1, что позволяет идентифицировать специфические структурные мотивы в PD-1, которые играют решающую роль во взаимодействии SHP2.

Протокол

1. Иммунопреципитация

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги следует выполнять на льду или при 4 °C.

1. Дополните буфер для лизиса (50 мМ Tris-HCl при pH 7,2, 250 мМ NaCl, 0,1% NP-40, 2 мМ ЭДТА, 10% глицерин) ингибиторами протеазы (растворите 1 таблетку в 10 мл буфера для лизиса) и 1 мМ ортованадатом натрия. Добавьте в клетки 500 μл ледяного буфера для лизиса и немедленно удалите и соберите клетки с планшетов с помощью скребка для клеток.
   заметка: Важно добавлять ортванадат натрия только в буфер для лизиса, который будет использоваться для PD-1-GFP-трансфицированных планшетов, поскольку SHP2-трансфицированные планшеты и нетрансфицированные контрольные планшеты должны сохранять активность фосфатазы.
2. Переложите лизаты в холодные пробирки объемом 1,5 мл и вращайте их при температуре 0,005 x g, 4 °C в течение 30 минут.
3. Чтобы собрать постядерную надосадочную жидкость (ПНС) из лизатов, замедлите лизаты в течение 10 мин при 10 000 x g при 4 °C и перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки. Выбросьте гранулы. Храните надосадочную жидкость второго набора из шести планшетов (рис. 1) на льду для последующего анализа лизата целых клеток.
4. Приготовление анти-GFP гранул для иммунопреципитации PD-1-GFP из PD-1-GFP-трансфицированных лизатов первого набора (четыре планшета) (рис. 1).
   1. Чтобы предотвратить оседание бусин, перед открытием аккуратно встряхните бутылку с бусинами. Удалите 40 мкл гранул, препятствующих GFP, из суспензии для каждого условия.
   2. Отжимайте при 500 x g в течение 3 минут при 4 °C и удалите надосадочную жидкость, чтобы промыть бусины.
      заметка: Важно свести к минимуму контакт между пластиковыми наконечниками пипетки и шариками агарозы, чтобы предотвратить потери. Рекомендуется срезать край наконечника объемом 200 μL перед переносом бусин в другую пробирку.
   3. Ресуспендируйте гранулы в 80 мкл буфера для лизиса (на образец).
5. Добавьте промытые шарики непосредственно в лизат клеток (ПНС) из клеток, экспрессирующих PD-1-GFP первого набора (четыре пластины) (шаг 1.3). Вращайте со скоростью 0,005 x g в течение 30 минут при 4 °C для иммунопреципитации белков, меченных GFP.
6. Промойте шарики 1 мл холодного буфера для лизиса (без ортованадата) 3 раза. Центрифугируйте пробирку при давлении 2 500 x g в течение 10 с.<бр/> заметка: Добавляя буфер для лизиса к бусинам, добавляйте его непосредственно на бусины, не касаясь их кончиками. Нет необходимости пипетировать вверх и вниз во время промывки.
7. Поровну разделите лизат активного SHP2 из первого набора (одна пластина; шаг 1.3) и добавьте его в три пробирки промытых гранул, содержащих PD-1-GFP (WT PD-1-GFP и две различные фосфодефицитные мутации, Y223F и Y248F). Добавьте одну треть объема лизата нетрансфицированных клеток во вторую пробирку гранул WT PD-1-GFP. Отбросьте оставшиеся две трети.
8. Инкубируйте шарики в течение 4 часов при температуре 4 °C с осторожной поворачивательной смесью (0,005 x g).
9. Дважды промойте шарики 1 мл буфера для холодного лизиса (без перванадата или ортвованада), как описано в шаге 1.6.
10. Добавьте 80 мкл буфера для лизиса (без перванадата или ортованадата) на образец, чтобы общий объем в каждой пробирке составлял 100 мкл (20 мкл гранул и 80 мкл буфера для лизиса). Аккуратно перемешайте и перелейте по 50 мкл из каждой пробирки в две свежие пробирки по 1,5 мл.
    заметка: После этого шага две пробирки будут заполнены смесью, содержащей гранулы и буфер для лизиса. Одна из пробирок будет использоваться для тестирования ко-иммунопреципитированного SHP2 методом вестерн-блоттинга.

2. Анализ вестерн-блота SHP2

1. Закрутите бусины вниз и удалите надосадочную жидкость.
2. Добавьте в гранулы 20 μл 2x буфера Laemmli (см. Таблицу материалов) и кипятите при 95 °C в течение 5 минут.
3. Измерьте концентрацию белка во входных контрольных группах (второй набор) с помощью набора BCA (см. таблицу материалов). Переложите 30 μл наиболее разбавленного образца в новую пробирку. Остальные входные элементы управления разбавляем буфером для лизиса до той же концентрации, что и наиболее разбавленный образец, и переливаем по 30 мкл из каждого из них в новую пробирку.
   заметка: После этого шага будут 4 пробирки по 30 мкл каждая, с аналогичными концентрациями белка, представляющие входные контрольные лизаты.
4. Добавьте равные объемы 2x буфера Laemmli к лизатам и кипятите при 95 °C в течение 5 мин. Уменьшите гранулы и загрузите надосадочную жидкость на 4–20% гель на основе триса SDS-PAGE (см. Таблицу материалов) для анализа вестерн-блоттинга. Кроме того, загрузите по 50 мкл из каждого образца второго набора.
5. Продолжите анализ вестерн-блоттинга.

Результаты

Рисунок 1: Условия эксперимента и стратегия. GFP-PD-1 WT (дикий тип), GFP-PD-1 Y223F (мутант ITIM) или GFP-PD-1 Y248F (мутант ITSM) экспрессировались в клетках HEK 293T, которые впоследствии обрабатывались перванадатом. Фосфорилированные белки GFP-PD-1, собранные с помощью иммунопреципитации GFP, смешивали с лизатами из клеток, гиперэкспрессирующих SHP2, и регистрировали уровни и активность SHP2, с...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нитроцеллюлозные мембраны	Дженерал Электрик	10600004
Микроцентрифуга	Эппендорф	5424-Р	1,5 мл
ВСА	рыбак	No 23225	Анализ на цинхониновую кислоту Bi
Анти-SHP2	Санта-Крус	СК-280
Анти-GFP-агароза	МБЛ	Д153-8
Анти-GFP	Рош	118144600
Анти-Актин	Санта-Крус	СК-1616
Элементы HEK-293	АТКС	ЦРЛ-1573
Ортванадат	сигма	С6508
Коктейль ингибиторов протеазы	Рош	11836170001	Без ЭДТА
Буфер для образцов трис-глицина SDS (2 шт.)	Инвитроген	ЛК2676	Модифицированный буфер Laemmli
4-20% трис-глицин мини гели	Инвитроген	XP04205BOX	15-луночный
Трипсин-ЭДТА (0,25%) Фенол красный	Gibco	25200114
NaCl	сигма	С7653	Хлорид натрия