Метод анализа взаимодействия между белками приманки и добычи на основе ИФА

Abstract

Источник: Singh, B. et al., Анализы для изучения роли витронектина в бактериальной адгезии и сывороточной резистентности. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео описывается метод на основе ИФА, который обнаруживает белок-белковые взаимодействия между двумя белками путем измерения связывания второго белка с иммобилизованным первым белком. Связанный второй белок обнаруживается с помощью специфических антител, меченных ферментом, таких как пероксидаза хрена.

Protocol

1. ИФА-анализ взаимодействия между рекомбинантным PH и Vn

ПРИМЕЧАНИЕ: Элементы управления должны быть включены, чтобы исключить неспецифическую привязку. Человеческий фактор H (FH) или C4b-связывающий белок (C4BP) используются в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно.

1. Разбавьте каждый из белков человека (Vn, FH и C4BP) отдельно до 50 нМ в Tris-HCl, pH 9,0 (буфер для покрытия). Дозируйте по 100 мкл белкового раствора в каждую лунку микротитровального планшета Polysorp. Закройте пластины крышкой и храните их при температуре 4 °C в течение ночи (16 часов), чтобы облегчить иммобилизацию белка на лунках микротитровальных пластин.
2. Слейте раствор с микротитровальной пластины, наклонив ее вверх дном над раковиной, и трижды промойте лунки 300 мкл PBS на лунку. Закупорить лунки с покрытием на 1 ч при РТ с помощью PBS, содержащей 2,5% (w/v) BSA (PBS-BSA).
3. После удаления блокирующего раствора трижды промойте лунки 300 мкл PBS, содержащим 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST) на лунку. Добавьте 100 мкл 50 нМ рекомбинантного PH, меченного His, в каждую лунку образца и инкубируйте в течение 1 ч при RT. В контрольные лунки добавляйте всего 100 мкл PBS-BSA.
   заметка: Ген lph, кодирующий PH из Hif, амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор экспрессии pET26b, который добавляет метку 6× His на С-конце экспрессированного белка. Рекомбинантный вектор преобразовывали в E. coli BL21(DE3) для экспрессии. Для очистки рекомбинантного белка использовалась смола Ni-NTA.
4. Выбросьте белковый раствор и удалите несвязанные белки, трижды промыв лунки 300 мкл PBST на лунку. Добавьте 100 мкл PBS-BSA, содержащего конъюгированную с пероксидазой хрена (HRP) анти-His pAbs (разведение 1:10 000) и инкубируйте в течение 1 ч в режиме ЛТ.
5. Приготовьте 20 мМ раствор А, растворив тетраметилбензидин в растворе 5% ацетона и 45% метанола. Для приготовления раствора В растворите 19,2 г лимонной кислоты в 1000 мл_Н2О, отрегулируйте рН до 4,25 путем добавления КОН, затем добавьте 230 мкл 30%_Н2О2. Храните оба решения в темноте в RT. Непосредственно перед применением смешайте 500 мкл раствора B с 9,5 мл раствора A для приготовления реагента для детектирования ИФА.
6. Промыть лунки три раза 300 мкл PBST на лунку и обнаружить комплексы антиген-антитела, добавив в каждую лунку по 100 мкл реагента для детектирования ИФА.
7. Добавьте 50 мкл 1 М Н₂СО₄ лунки, чтобы остановить реакцию. Измерьте оптическую плотность лунок на длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Датчики AR2G	Пэлл Медико-биологические науки	18-5095 (Английский	Датчик иммобилизованного белка с помощью аминосвязи
ацетон	ВВР	97064-786	Содержание в анализе
Бычьи сывороточные альбумины (BSA)	Сигма-Олдрич	А2058	Подходит для культивирования клеток
C4BP (C4b-связывающий белок)	Комплемент Технолоджи, Инк.	А109	Куплено как Замороженная жидкая форма
лимонная кислота	Сигма-Олдрич	251275-500Г	Класс Американского химического общества (ACS)
HRP-конъюгированные антитела к метке His	Абкам	АБ1269	Поликлональные
С4ВР	Комплемент Технолоджи, Инк.	А109	Замороженный раствор
Колонка из аффинной смолы к гистидину (HisTrap HP)	GE Здравоохранение Медико-биологические науки	Тел.: 17-5247-01	Колонны предварительно упакованы с Ni Sepharose
Его тег PH			Рекомбинантно экспрессируется и очищается в нашей лаборатории
Метано	ВВР	BDH1135-1LP	Содержание в анализе
Плазмида, содержащая С-концевую 6x His-метку на костяще (pET26(b))	Новаген	69862-3	ДНК-вектор
Микротитровые пластины Polysorb	Сигма-Олдрич	М9410	Для ИФА
Тетраметилбензидин	Сигма-Олдрич	860336-100МГ	Класс ИФА
Витронектин (Vn) из плазмы крови человека	Сигма-Олдрич	В8379-50УГ	Сорт клеточной культуры