Кондуктирометрический биосенсорный анализ на основе β-лактамаз для белок-белковых взаимодействий

Аннотация

Источник: Vandevenne, M., et al. Использование проводимого биосенсорного анализа на основе β-лактамаз для обнаружения биомолекулярных взаимодействий. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует кондуктивный биосенсорный анализ для изучения взаимодействия антитела с целевым антигеном, иммобилизованным на чипе преобразователя. Биосенсор спроектирован таким образом, чтобы иметь бифункциональный химерный белок — фермент β-лактамазу с функциональным каталитическим центром, слитый с нанотелом для связывания с иммобилизованным антигеном-мишенью. При связывании каталитический гидролиз субстрата антибиотика ферментом β-лактамазой генерирует электрический сигнал, подтверждающий взаимодействие антиген-антитело.

Протокол

1. Подготовка образцов белка

1. Продуцируйте и очистите гибридный белок BlaP-cAb-Lys3, как сообщалось в нашем предыдущем исследовании. Хранить белок в 50 мМ фосфатном буфере рН 7,4 со следующим составом: 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ растворить растворить в 800 мл дистиллированной воды Зафиксировать рН раствора до 7,4 до корректировки конечного объема раствора до 1 л. Фильтр стерилизовать белковый раствор.
2. Приготовьте из куриного яйца поточный раствор лизоцима (HEWL). Растворите 100 мг (40 000 ЕД/мг) коммерчески приобретенного HEWL в 10 мл фосфатного буферного раствора (PBS см. шаг 2.1.1). Стерилизуют белковый раствор путем фильтрации с помощью фильтров с отсечкой 0,22 мкм.

2. Биосенсорные анализы

1. Приготовление растворов и буферов
   1. Приготовьте 50 мМ PBS, растворив 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄ и 0,24 г KH₂PO₄ в 800 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте до pH 7,4 с помощью 1 N HCl или 1 N NaOH, прежде чем регулировать объем раствора до 1 л. Процедите и храните при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте питательный/блокирующий раствор, растворив 3 г гидролизата казеина в 100 мл PBS, приготовленного как описано выше (см. шаг 2.1.1). Фильтр простерилизовать и хранить при температуре 4 °C.
   3. Приготовьте связующий раствор, растворив 1 г гидролизата казеина в 100 мл PBS, приготовленного, как описано выше (см. шаг 2.1.1). Фильтр простерилизовать и хранить при температуре 4 °C.
   4. Приготовьте моющий раствор (0,1% Tween - PBS), добавив 100 мкл Tween 20 (100%) в 100 мл PBS, приготовленного как описано выше (см. шаг 2.1.1). Хранить при температуре 4 °C.
   5. Приготовьте раствор для получения электродов (1% Triton X-100 - PBS), добавив 1 мл Triton X-100 (100%) в 100 мл PBS, приготовленного как описано выше (см. шаг 2.1.1). Хранить при температуре 4 °C.
   6. Приготовьте раствор для регенерации электродов (3,5 М KCl) путем растворения 26 г KCl в дистиллированной воде до конечного объема 100 мл. Процедить стерилизовать и хранить при температуре 4 °C.
   7. Приготовьте 5 мМ раствор NaCl, растворив 0,29 г NaCl в дистиллированной воде до конечного объема 1 л. Фильтр простерилизовать и хранить при температуре 4 °C. Затем готовят детектирующий раствор (4 мМ бензилпенициллина) путем растворения 26,7 мг бензилпенициллина в 20 мл 5 мМ раствора NaCl. Фильтр простерилизовать и хранить при температуре -20 °C.
2. Подготовка и регенерация датчика
   заметка: Сенсорные чипы с полианилиновым покрытием были разработаны и любезно предоставлены доктором. Богертсом, доктором С. Юнусом и профессором Ю. Глупчински (Католический университет Лувен-ла-Нёв - CHU Mont-Godinne). Описание сенсора, а также протоколы электрополимеризации полианилина, используемые для синтеза этих сенсоров, подробно описаны в их предыдущей работе. Вкратце, в этой системе используются многоразовые датчики восьми отдельных чипов, которые были изготовлены с использованием классических технологий печатных плат (PCB). Отдельные чипы состоят из трех круглых электродных пятен. Верхний – это рабочий электрод, на котором был произведен электросинтез полианилина. Средний электрод является электродом сравнения, а нижний электрод представляет собой противоэлектрод. Как эталонный, так и противоэлектрод функционализированы с использованием твердой амальгамы Ag/AgCl поверх углеродного слоя.
   1. Выполните 3 промывки электродов, погрузив наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 мкл/лунку раствора электродной подготовки (1% Triton X-100 - PBS, см. шаг 2.1.5.). Выполняйте каждую стирку в течение 2 минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре.
   2. Промойте электроды, опустив наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 μл/лунку дистиллированной воды, на 2 минуты при осторожном перемешивании при комнатной температуре.
   3. Регенерируйте электроды, опуская наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 мкл/лунку раствора регенерации (3,5 М KCl, см. шаг 2.1.6) в течение ночи при 4 °C или 1 ч при комнатной температуре.
   4. Выполните 3 промывки электродов, погрузив наконечники в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 мкл/лунку фосфатного буферного раствора (см. шаг 2.1.1.). Выполняйте каждую стирку в течение 2 минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре.
3. Анализ связывания, проводимый на сенсоре
   1. Нанесите HEWL на PANI (полианилиновую) поверхность электрода путем нанесения на поверхность электрода капли объемом 15 мкл из 40 мкг/мл HEWL, приготовленного в PBS. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C или 1 час при комнатной температуре.
   2. Выполните три промывки электродов фосфатным буферным раствором (см. шаг 2.1.1), погрузив электродные части чипов датчика в лунки 96-луночного планшета, содержащего 300 мкл/лунку фосфатного буферного раствора. Выполняйте каждую стирку в течение 2 минут, аккуратно перемешивая при комнатной температуре.
   3. Насытите электроды, добавив каплю блокирующего раствора объемом 50 мкл (см. шаг 2.1.2) на поверхность электрода. Выдерживать в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем постирайте три раза, как описано на предыдущем шаге (см. шаг 2.3.2).
   4. Раствор BlaP-cAb-Lys3 развести до 20 мкг/мл в связующем растворе (см. шаг 2.1.3) и нанести каплю этого разбавленного раствора в 15 мкл на электроды. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. После реакции антиген-нанотело промыть три раза, как описано на предыдущем этапе, используя раствор для промывки (см. шаг 2.1.4). Затем один раз промойте электрод PBS (см. шаг 2.1.1).
   5. Для обнаружения подключите микросхему датчика через медную схему к цифровому мультиметру. Затем инициируйте реакцию датчика, нанеся каплю раствора детектирования объемом 50 мкл (см. шаг 2.1.7) на положительные электроды и каплю 50 мкл раствора NaCl 5 мМ на отрицательные электроды (см. шаг 2.1.7). Выдерживать 30 минут при комнатной температуре. Контролируйте проводимость с помощью цифрового мультиметра.
      заметка: Мультиметр был предоставлен доктором. Богартсом, доктором С. Юнусом и профессором Ю. Глупчинским (Католический университет Лувен-ла-Нёв - CHU Mont-Godinne. Этот потенциостат управляется компьютером через USB-порт и анализирует восемь различных чипов датчика одновременно. Программное обеспечение, созданное Юнусом и его коллегами, создает график в режиме реального времени, который представляет собой измерения разницы проводимости между электродами сравнения и образца в зависимости от времени.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
КХ2ГО4	Сигма-Олдрич	V000225
К2ГПО4	Сигма-Олдрич	1551128
NaCl	Сигма-Олдрич	С7653
Tris–HCl	Рош	10812846001
Эдта	Сигма-Олдрич	Е9884
KCl	Сигма-Олдрич	П9541
Na2HPO4	Сигма-Олдрич	NIST2186II
2-меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	М6250
Аланин	Сигма-Олдрич	А7627
HClO4	Флюка	No 34288 (Английский	Решение 1M HClO4, дистрибьютор: Sigma-Aldrich
Гидролизат казеина	Сигма-Олдрич	22090
Бензилпенициллин натрия	Сигма-Олдрич	B0900000
Лизоцим белка куриного яйца	Рош	10837059001
гептан	Сигма-Олдрич	246654
метанол	Сигма-Олдрич	322415
Раствор гидроксида аммония	Сигма-Олдрич	380539	28%NH3 в H2O, очищенный двойной дистилляцией (концентрированный?)
Расходные материалы для лабораторий
6-луночный планшет	Greiner Bio-One	657165	CELLSTAR 6-луночный планшет
оборудование
pH-метр	WTW	1АА110	Лабораторный pH-метр inoLab pH 7110
Вакуумная и фильтрационная система	Налген	NALG300-4100	Держатели фильтров с ресивером, распределителем: VWR
Потенциометрические сенсорные чипы			производство Юнус и коллеги (арт. 16)
PGSTAT30 Автолаб	Метром Автолаб		снят с производства, преемник Autolab PGSTAT302N
Цифровой мультиметр METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		снят с производства, преемник Metrahit Base

) г.