1. Клетки
- За два дня до начала процедуры нанесите пластины на клетки с необходимой плотностью, чтобы они сливались в день эксперимента. Разложите ячейки по колбам или тарелкам. Однако извлечение белка будет проще из тарелок. Удобно готовить не менее 4 тарелок по 78 см2 или 2 колбы по 150 см2 на условие для каждого эксперимента, чтобы быть уверенным в согласованности результатов.
- В этом исследовании человеческие G166 GSC в 4 колбах по 150см2, культивируемые в среде стволовых клеток RHB-A с добавлением 2% B27, 1% N2, 20 нг/мл EGF и b-FGF, как описано Pollard et al. Процесс, когда было достигнуто слияние. Например, когда ячейки 5 x 106 G166 были помещены в колбу 150 см2, они были обработаны через 2 дня после покрытия.
2. Биотинилированные СРК
- Вращайте флаконы, содержащие лиофилизированные биотинилированные ЦПК (БЦПП), при 8200 x g в течение 30 с, чтобы избежать попадания порошка на крышку. Включите элемент управления BCPP, чтобы убедиться, что найденные взаимодействия специфичны для целевой последовательности. В этом исследовании контрольным BCPP был TATbiotin (TAT-B), а лечением BCPP был TAT-Cx43266-283-B. Можно использовать и другие меры контроля, такие как ТАТ, слитый с скремблированными или мутировавшими фрагментами, связанными с биотином.
- Растворяют БЦФП в соответствующей питательной среде в исходном растворе, указанном производителем; например, для получения исходного раствора в концентрации 2 мг/мл БЦФП для обработки ГСК добавьте 0,5 мл питательной среды ГСК в один флакон, содержащий 1 мг БКПП. Сделайте вихрь и убедитесь, что пептид хорошо растворился.
3. Трубки
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте не менее двенадцати пробирок объемом 1,5 мл в соответствии с условиями, указанными в разделе
- Отметьте первые 3 пробирки для каждого условия. В них будет указан общий объем клеточных лизатов, полученный на шаге 6.4.
- Отметьте букву А в 3 пробирках для каждого условия. В этих пробирках будут первые надосадочные жидкости, полученные после лизиса и вращения клеточных лизатов, шаг 7.2.
- Отметьте букву B в 3 пробирках для каждого условия. Эти трубки будут иметь небольшую аликвоту первых надосадочных жидкостей. Эти лизаты будут служить образцами вестерн-блоттинга на шаге 7.3.
- Отметьте букву C в 3 пробирках для каждого условия. В этих пробирках будут находиться надосадочная жидкость, полученная после вытягивания с помощью NeutrAvidin, шаг 7.7.
заметка: Это важно в случае, если вестерн-блоттинг не показал сигнала для белков, то есть белки не были снижены или были потеряны на каком-то этапе процедуры. Если это так, повторите процесс, чтобы вытянуть белки вниз.
4. Клеточное лечение с помощью BCPPs
- Аспирируйте питательную среду.
- Замените соответствующий объем свежей среды, необходимый для инкубации BCPP, в минимально возможном объеме среды в соответствии со временем инкубации. Очень важно, чтобы в любом случае среда покрывала полностью всю поверхность планшета/колбы, чтобы клетки не пересыхали, например, 6 мл на 150 см2 за 30 минут инкубации.
- Добавьте объем исходного раствора BCPP к культурам клеток, чтобы достичь концентрации, эффективность которой была доказана. В этом исследовании было доказано, что 50 мкМ TAT-Cx43266-283-B снижает пролиферацию GSC.
- Поэтому добавляют 92,8 мкл 2 мг/мл TAT-Cx43266-283-B (MW=3723,34 г/моль) на мл питательной среды для получения конечной концентрации 50 мкМ TAT-Cx43266-283-B. Если добавляемый объем для контрольных пептидов различен, укомплектуйте питательной средой до того же конечного объема. Например, 49,1 мкл тат-в (MW=1914,31 г/моль) плюс 43,7 мкл среды GSC добавляли на мл питательной среды для получения конечной концентрации 50 мкМ TAT-B.
- Поместите клетки в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на 30 минут, чтобы убедиться в том, что взаимодействие между BCPP и его внутриклеточными партнерами происходит. Если взаимодействие занимает больше времени, инкубируйте в течение более длительного времени или скорректируйте время, если эксперимент состоял из временного хода. Кроме того, интересующее взаимодействие может быть усилено или предотвращено путем стимуляции различных внутриклеточных сигнальных путей.
5. Буферы и решения
- Готовят PBS pH 7,4: 136 мМ NaCl; 2,7 мМ KCl; 7,8 мМ Na2HPO4·2H2O; 1,7 мМ KH2PO4.
- Приготовьте буфер для лизиса белка: 20 мМ Tris-HCl (pH 8,0), 137 мМ NaCl, 1% IGEPAL, Перед использованием добавьте следующее: 1/100 (v/v) коктейля ингибитора протеазы, 1 мМ фторида натрия, 1 мМ фенилметансульфонилфторида (PMSF) и 0,1 мМ ортованадата натрия.
- Приготовьте буфер Laemmli: (4x: 0,18 М Tris-HCl pH 6,8; 5 М глицерин; 3,7 % SDS (p/v); 0,6 M β-меркаптоэтанол или 9 mM DTT; 0,04 % (v/v) бромофеноловый синий (BB)).
6. Экстракция белка
ПРИМЕЧАНИЕ: Экстракция белка проводилась, как описано ранее. Проводите весь этот участок процедуры при температуре 4 °C.
- Полностью отсадите питательную среду.
- Тщательно промойте 3 x 10 мл ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS) на 150 см2 во избежание отслоения клеток.
- Чтобы получить лизат клеток, добавьте 3 мл буфера для лизиса на 150 см2 и тщательно соскребите поверхность с помощью скребка для клеток. Наклон тарелки/колбы примерно на 45 градусов облегчит сбор лизатов клеток в соответствующие пробирки.
- Налейте 1 мл клеточного лизата на пробирку в три пробирки по 1,5 мл. Эти пробирки будут помечены с указанием состояния и репликации, как указано на шаге 3.1.
7. Выпадающий
список
- Центрифугируйте пробирки объемом 1,5 мл при давлении 11 000 x g в течение 10 мин при 4 °C.
- Перенесите надосадочную жидкость в новые пробирки (А).
- Возьмите аликвоту этой надосадочной жидкости для каждого условия в разные пробирки (В), т.е. 50 мкл на пробирку. Добавьте 4x буфер Laemmli (16,6 мкл на 50 мкл лизата) и заморозьте при -20 °C. Эти лизаты будут служить обычными образцами вестерн-блоттинга.
- Очень хорошо гомогенизирует NeutrAvidin Agarose путем легкого встряхивания. Обрежьте кончики наконечников пипеток, чтобы увеличить их диаметр и улучшить пипетирование шариков. Добавьте 50 мкл NeutrAvidin Agarose на мл клеточного лизата в (А) пробирках.
- Инкубируйте при 4 °C в течение ночи с очень легким встряхиванием, чтобы позволить NeutrAvidin взаимодействовать с BCPP, связанными со своими внутриклеточными партнерами.
- Центрифугируйте при 3000 х г в течение 1 мин при 4 °С, чтобы собрать комплекс NeutrAvidin с белками.
- Осторожно извлеките надосадочную жидкость и переложите их в чистые пробирки (С). Сохраните их, чтобы использовать в случае неудачного вытягивания.
- Этапы промывки: добавьте свежий буфер для лизиса в гранулы (пробирки А), повторно суспендируйте путем инверсии и повторите шаги 7.6 и 7.7 еще пять раз. От всех этих надосадочных пластов можно отказаться.
- Удалите надосадочную жидкость и добавьте 2x Лаеммли буфер до желаемого конечного объема (40 μЛ на 1,5 мл пробирки для гранул, полученных из2 см колб сливающихся клеток).
- Разбавьте при 100 °C в течение 5 мин для диссоциации взаимодействий между белками и центрифугируйте в течение 30 с при 8 200 x g для гранулирования гранул NeutrAvidin.
- Возьмите надосадочную жидкость, содержащую диссоциированные белки, с капиллярными концами к новым пробиркам (D). Бусины можно сохранить на случай, если потребуется повторение этапов элюирования.
заметка: Надосадочная жидкость (пробирки D) теперь готова к загрузке в вестерн-блот или к замораживанию при -20 °C.
