Двухгибридный анализ дрожжей для определения белковой самоассоциации в дрожжевых клетках

Аннотация

Источник: Stanczyk, P. J., et al., Генетические и биохимические подходы к оценке олигомеризации белков in vivo и in vitro: тематическое исследование рецептора рианодина. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует двухгибридный анализ дрожжей для обнаружения специфических белковых взаимодействий. В этом анализе интересующий белок помечен двумя доменами транскрипционного фактора, который кодирует фермент β-галактозидазу. Когда два белка взаимодействуют, это приводит к транскрипции и трансляции с образованием фермента, который затем обнаруживается с помощью биохимического анализа.

Протокол

1. Трансформация дрожжей

1. Соберите дрожжи центрифугированием (в пробирках по 50 мл) при концентрации 1 500 x g в течение 5 минут при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте каждую гранулу в 5 мл стерильного H₂O и объедините вместе.
2. Повторно центрифугируйте при 1500 x g в течение 5 минут при RT и выбросьте надосадочную жидкость. Суспендировать дрожжевую гранулу в 1 мл свежеприготовленного, стерильного 1x LiAc/TE.
   заметка: Используйте компетентные дрожжевые клетки в течение 1 часа после приготовления.
3. Подготовьте образцы плазмид (в пробирках объемом 1,5 мл), добавив 200 нг плазмидной ДНК для одиночных превращений, или 0,5 - 1 мкг каждой плазмидной ДНК для копревращений, и 100 мкг ДНК-носителей яичек сельди (кипятят в течение 20 мин и охлаждают на льду непосредственно перед использованием).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Включите положительный контроль, например, дрожжи, котрансформированные с pVA3 (кодирующие для слияния GAL4 ДНК-BD с белком p53) и pTD1 (кодирующие для слияния GAL4 AD с большим Т-антигеном SV40).
4. Добавьте 100 μл свежеприготовленной питательной дрожжевой суспензии и 600 μл 1x раствора LiAc/PEG (8 мл стокового PEG 3350, 1 мл стокового TE, 1 мл стокового LiAc) и вортекс в течение ~30 сек. Инкубируйте при 30 °C в течение 30 мин с встряхиванием при 200 об/мин.
5. Добавьте 80 μл диметилсульфоксида (конечная концентрация 10% v/v) и хорошо перемешайте путем мягкой инверсии. Тепловой шок в течение 15 минут на водяной бане 42 °C с одновременным перемешиванием каждые 2 - 3 минуты.
6. Охладите суспензию ячейки на льду в течение 2 минут и центрифугируйте при 14 000 x g в течение 15 секунд при RT для извлечения дрожжей.
7. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1x TE и поместите ее на соответствующие минимальные средние планшеты SD для селективного роста (в среде отсутствуют лейцин и триптофан для поддержания селективного давления как на приманку, так и на плазмиды-мишени).
8. Инкубируйте чашки вверх дном при температуре 30 °C до тех пор, пока колонии не достигнут ~2 мм в диаметре (обычно 4-5 дней). Тарелки можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 - 3 недель; для более длительного хранения изготавливают запасы глицерина и хранят при температуре -80 °С.<бр/> заметка: Убедитесь, что белки-приманки и целевые белки экспрессируются в дрожжах методом иммуноблоттинга и что они не имеют автономной активации репортерного гена при раздельной экспрессии в дрожжах.
9. Добавьте 100 μл свежеприготовленной питательной дрожжевой суспензии и 600 μл 1x раствора LiAc/PEG (8 мл стокового PEG 3350, 1 мл стокового TE, 1 мл стокового LiAc) и вортекс в течение ~30 сек. Инкубируйте при 30 °C в течение 30 мин с встряхиванием при 200 об/мин.
10. Добавьте 80 μл диметилсульфоксида (конечная концентрация 10% v/v) и хорошо перемешайте путем мягкой инверсии. Тепловой шок в течение 15 минут на водяной бане 42 °C с одновременным перемешиванием каждые 2 - 3 минуты.
11. Охладите суспензию ячейки на льду в течение 2 минут и центрифугируйте при 14 000 x g в течение 15 секунд при RT для извлечения дрожжей.
12. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл 1x TE и поместите ее на соответствующие минимальные средние планшеты SD для селективного роста (в среде отсутствуют лейцин и триптофан для поддержания селективного давления как на приманку, так и на плазмиды-мишени).
13. Инкубируйте чашки вверх дном при температуре 30 °C до тех пор, пока колонии не достигнут ~2 мм в диаметре (обычно 4-5 дней). Тарелки можно хранить при температуре 4 °C в течение 2 - 3 недель; для более длительного хранения изготавливают запасы глицерина и хранят при температуре -80 °С.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что белки приманки и мишени экспрессируются в дрожжах методом иммуноблоттинга и что они не имеют автономной активации репортерного гена при раздельной экспрессии в дрожжах.

2. Колонийно-лифтовая фильтровальная бумага β-галловый анализ

1. Подготовьте следующие буферы:
   1. Приготовьте Z-буфер, содержащий 100 мМ Na₂HPO₄, 40 мМ₂PO₄, 10 мМ KCl и 1 мМ MgSO₄; отрегулируйте pH до 7,4. Стерилизовать автоклавированием и хранить в RT.
   2. Приготовьте буфер X-Gal, растворив 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид в концентрации 20 мг/мл в N,N-диметилформамиде и храните в темноте при -20 °C. Приготовьте Z-буфер/раствор X-Gal. Сделайте буфер перед использованием, смешав X-Gal в концентрации 0,33 мг/мл и β-меркаптоэтанол в концентрации 0,27% v/v в Z-буфере. Используйте 2,5 мл на образец.
2. Добавьте 2,5 мл свежеприготовленного Z-буфера/раствора X-Gal в чистую 100-миллиметровую пластину и поместите ее внутрь целлюлозной фильтровальной бумаги.
3. Положите новую фильтровальную бумагу на поверхность пластины с колониями дрожжей, которые необходимо исследовать. Аккуратно вотрите фильтровальную бумагу в тарелку щипцами и оставьте на ~5 минут, чтобы прикрепились колонии.
   заметка: Параллельно обрабатывайте положительный контроль, т.е. дрожжи, совместно трансформированные с pVA3 и pTD1.
4. Поднимите фильтровальную бумагу и погрузите ее (с помощью щипцов) в лужу жидкого азота на 30 секунд (с жидким азотом следует обращаться осторожно; всегда надевайте толстые перчатки и очки). Дайте замороженной фильтровочной бумаге оттаять при RT в течение ~2 минут.
5. Поместите фильтровальную бумагу колонией вверх поверх предварительно замоченной фильтровальной бумаги внутри пластины диаметром 100 мм и инкубируйте при температуре 30 °C.
6. Периодически (каждые ~30 минут) проверяйте наличие синих колоний.
   заметка: Слабая приманка: для получения положительного синего сигнала при взаимодействии с целью может потребоваться несколько часов (избегайте длительной инкубации (>8 часа), которая может дать ложноположительные результаты). Для достижения наилучших результатов используйте свежетрансформированные колонии, т.е. выращенные при температуре 30 °C в течение 4 - 5 дней, ~ 2 мм в диаметре.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пластинчатый инкубатор	Гереаус	В6120	устройство
Орбитальный вибрационный инкубатор	Научный центр Нью-Брансуика	ИННОВА 4300	устройство
спектрофотометр	Перкин Элмер	Лямбда Био+	устройство
Комплект Matchmaker Two-Hybrid System 2	Такара Клонтек	К1604-1	Содержит вектор приманки pGBKT7, вектор добычи pACT2 и штамм дрожжей Y190
Дрожжевое азотное основание	Сигма-Олдрич	У0626	Для приготовления минимального SD питательной среды
Выбывшая добавка с недостатком лейцина и триптофана	Сигма-Олдрич	У0750	Для приготовления минимального SD питательной среды
При выпадении добавки не хватает лейцина, триптофана, гистидина	Сигма-Олдрич	2001 год	Для приготовления минимального SD питательной среды
Яички сельди являются носителями ДНК	Такара Клонтек	630440 (Английский	Для трансформации дрожжей
Фильтровальная бумага ватман 5 класс	Сигма-Олдрич	WHA1005070	Для использования в колонийной фильтровальной бумаге β-Gal
X-Gal (5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид)	Сигма-Олдрич	В4252	Для использования в колонийной фильтровальной бумаге β-Gal

)