Тандемный аффинный анализ очистки для изучения белок-белковых взаимодействий

Аннотация

Источник: Ma, Z., et al. Тандемная аффинная очистка белковых комплексов из эукариотических клеток. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует тандемную аффинную очистку — метод очистки белковых комплексов из эукариотических клеток для изучения белок-белкового взаимодействия. Комплекс содержит два белка, меченных разными эпитопными метками. При последовательной очистке комплекса с использованием двух смол со сродством к двум различным меткам, присутствие обоих белков в элюировании подтверждает взаимодействие между ними.

Протокол

1. Гальванические ячейки

1. За сутки до трансфекции планшет 3,5 x 10⁶ HEK293T клетки в 10 мл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (v/v) пенициллина/стрептомицина (10 000 ЕД/мл бульона) на 100 мм чашку. Тарелка 3 - 5 100 мм² чашки на эксперимент/условие для обеспечения достаточного извлечения белка.
   заметка: Количество планшетов должно быть определено для каждого эксперимента/условия, которое будет зависеть от уровней экспрессии и растворимости интересующего белкового комплекса. В качестве альтернативы, если требуется более масштабная очистка, клеточные линии могут быть адаптированы для выращивания в суспензиях в колбах-спиннерах, но этот метод не будет работать для транзиторных трансфекций.

2. Трансфекция клеток или индуцирование стабильных клеточных линий

1. На следующий день проверьте клетки под микроскопом. Клетки должны быть на 70 - 80% слитыми, прежде чем продолжить.
2. Трансфектируйте клетки общей смесью 7 мкг плазмидной ДНК и 21 мкл реагента для трансфекции на 100 мм чашку. Трансфектные клетки с вектором, экспрессирующим GFP (Таблица 1) в качестве контроля эффективности трансфекции.
   заметка: При использовании HEK293-T-REx или аналогичной стабильной клеточной линии, которая индуцирует экспрессию двух или более сложных субъединиц в ответ на доксициклин, индуктор должен быть добавлен к клеткам и инкубирован в течение 48 часов. Аналогичным образом, для целей валидации также потребуется стабильная клеточная линия, которая индуцирует экспрессию GFP при добавлении индуктора. Перейдите к шагу 2.7.
3. Приготовьте трансфекционную смесь на 100 мм посуду. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл смешайте 500 мкл недополненного DMEM с 7 мкг общей плазмидной ДНК (что соответствует двум или более плазмидам). В отдельной микроцентрифужной пробирке смешайте 500 μл недополненного DMEM с 21 μл реагента для трансфекции. Повторяйте для каждой реакции трансфекции.
4. Пипеткой введите раствор реагента для трансфекции в раствор плазмидной ДНК (не смешивайте растворы в обратном порядке). Перемешайте пипеткой не менее 4 раз.
5. Инкубируйте эту смесь при комнатной температуре в течение 10 - 15 минут, но не дольше 15 минут.
6. Наклоните пластину, чтобы создать резервуар для среды, и осторожно нанесите смесь для трансфекции по каплям на внутреннюю сторону пластины, не повреждая клетки. Верните блюдо в исходное плоское положение и аккуратно перемешайте, чтобы распределить смесь.
7. Инкубируйте клетки при температуре 37 °C в увлажнённом инкубаторе для клеточных культур с 5%_CO2 (в дальнейшем это условие именуется «инкубатором для тканевых культур»). Замените носитель через 5 часов после трансфекции (по желанию).

3. Проверка эффективности трансфекции или индукции

1. Через 24 часа после трансфекции визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом, чтобы проверить эффективность трансфекции (или индукции контрольной стабильной клеточной линии HEK293T-REx, экспрессирующей GFP). Инкубировать еще 24 часа.

4. Аффинная очистка STREP (STREP AP)

1. Сбор ячеек
   1. Через 48 часов после трансфекции удалите среду и добавьте 8 мл холодного 1x фосфатно-солевого буфера (PBS). Проводите пипеткой вверх и вниз, чтобы отделить ячейки от пластины.
   2. Соберите и перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и вращайте клетки при 800 x g в течение 4 минут при 4 °C.
   3. Удалите надосадочную жидкость PBS. Повторите отжим вниз (800 x g в течение 1 минуты при 4 °C), чтобы удалить остатки PBS. Храните клеточную гранулу при температуре -80 °C для дальнейшего использования в будущем или следуйте приведенной ниже процедуре, чтобы продолжить очистку белка.
2. Лизис клеток
   1. Ресуспендируйте клеточные гранулы, используя 5× объема клеточных гранул (~250 мкл на планшет) буфера пассивного лизиса (PLB: 20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, коктейльную таблетку ингибитора протеазы, 5% v/v глицерина и 1,0% NP-40) и перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
   Кратковременно перемешайте
   2. суспензию и пируйте в течение 30 минут при температуре 4 °C.
   3. Уменьшите клеточную суспензию при 10 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
   4. Перелейте растворимые лизаты в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и выбросьте гранулы клеток. Сохраните 10% от конечного объема растворимого лизата в виде «STREP AP Input». Хранить при температуре 4 °C.
3. Уравновешивание шариков STREP
   заметка: Используйте бусины STREP для первого шага AP! Комплексы, снятые с помощью шариков STREP, восстанавливают значительно больше белка, чем комплексы, полученные с помощью шариков FLAG.
   1. Выньте (n × 40 μл) + n μл 50% суспензии гранул STREP (n = количество образцов) и уменьшите при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте кончики с широким горлышком для пипетки бусинами.
   2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте в гранулы 500 μл PLB. Взбейте смесь гранул в течение 5 минут при 4 °C. Отжим при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C.
      1. Повторите в общей сложности 3 стирки. Суспендируйте шарики в PLB до конечного объема n × 40 μл.
   3. Добавьте 40 мкл суспензии из гранул 50% STREP в каждый образец лизата клеток и пытайтесь в течение 2 часов при 4 °C.
4. СТРЕПТОКОКК AP
   1. Уменьшите температуру раствора при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C.
   2. Удалите надосадочную жидкость и храните ее как "STREP AP Flow-through (FT)" при температуре 4 °C.
   3. Добавьте в гранулы 500 мкл промывочного буфера STREP AP Wash Buffer I (20 мМ Tris-HCl pH 7,5, 250 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl₂, 1 мМ DTT, 5% глицерина и 0,2% NP-40). Измельчите смесь гранул в течение 5 минут при 4 °C и центрифугируйте при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость.
      1. Повторите в общей сложности 4 стирки.<бр/> заметка: Перед четвертой промывкой переложите раствор шариков в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для снижения белкового фона. Этот шаг очень важен.
   4. Добавьте 500 мкл Wash Buffer II (100 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА) и уравновесьте шарики, перевернув пробирки. Отжимайте при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость.
   5. Разбавьте интересующий белок 50 мкл буфера для элюирования STREP (100 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 2,5 мМ дестиобиотин). Вихрь при 800 об/мин в течение 15 мин при 4 °C.
   6. Уменьшите количество шариков при 1 500 x g в течение 1 минуты при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость. Эта фракция соответствует образцу «STREP AP Elution».
   7. Сохраните фракцию гранул при температуре 4 °C для второго элюирования, которое может дать до половины количества белка, полученного при первом элюировании. Аликвота 10% STREP AP Elution для окрашивания серебром и/или вестерн-блоттинга.
5. Уравновешивание бусин FLAG
   1. Выньте (n x 16 μl) + n μl раствора шариков FLAG (n = количество образцов) и уменьшите при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C.
      заметка: Используйте кончики с широким горлышком для пипетки бусин.
   2. Удалите надосадочную жидкость и добавьте в гранулы 500 мкл промывочного буфера FLAG (100 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 0,1% NP-40). Отжимайте при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Повторите в общей сложности 3 стирки.
   3. Суспендируйте шарики в буфере для промывки FLAG до конечного объема n x 16 μl.
   4. Добавьте 16 μл суспензии для гранул FLAG к оставшемуся элюированию STREP AP и поставьте на ночь при температуре 4 °C.

5. ФЛАГ IP

1. Уменьшите суспензию шариков FLAG при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Сохраните надосадочную жидкость и храните ее как "FLAG IP Flow-through" (FT) при 4 °C.
2. Добавьте в раствор 500 μл промывочного буфера FLAG. Натайте в течение 5 минут при 4 °C и центрифугируйте при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Повторите в общей сложности 4 промывки и удаляйте надосадочную жидкость после каждой промыв><ки. заметка: Перед четвертой промывкой переложите белково-шариковый раствор в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для уменьшения фона. Этот шаг очень важен.
3. Удалите надосадочную жидкость из конечного отжима и добавьте в гранулы 30 мкл промывочного буфера FLAG, содержащего 200 нг/мкл пептида FLAG. Вихрь при 800 об/мин в течение 2 часов при 4 °C.
4. Уменьшите температуру суспензии при 1 500 x g в течение 2 минут при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и храните при 4 °C как "FLAG IP Elution".
   заметка: Образцы элюирования могут быть подтверждены с помощью окрашивания серебром и/или вестерн-блоттинга с использованием стандартных протоколов и готовы к дальнейшим анализам белка. При настройке вестерн-блоттинга выполните все следующие примеры: (1) STREP AP Input, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elution, (4) FLAG IP FT и (5) FLAG IP Elution. Загруженные объемы должны быть определены для каждого эксперимента. Все собранные образцы и бусины могут храниться при температуре 4 °C при кратковременном хранении и при -80 °C при длительном хранении. Образцы TAP могут быть проанализированы с помощью масс-спектрометрии для проверки идентичности их компонентов, идентификации новых посттрансляционных модификаций (PTM) и/или обнаружения любого нового взаимодействия белка с очищенным комплексом. Для этой цели, после нанесения геля кумасси или серебряного пятна, из геля можно вырезать полосы с помощью чистого скальпеля. Ранее было опубликовано несколько отличных обзоров, в которых обсуждаются методы масс-спектрометрии.

Результаты

Таблица 1: Плазмиды, использованные в данном исследовании. CycT1 и CDK9 лигировали в плазмидные векторы pcDNA/4TO-STREP и pcDNA/4TO-FLAG. Эти конструкции были преобразованы в DH5α-компетентные клетки и нанесены на пластины LB-ампициллина. Колонии отбирались, выращивались и проверялись. Успешно лигированные клоны были проверены с помощью секвенирования по Сэнгеру и комбинации рестрикционного расщепления и электрофореза в агарозном геле. Для CycT1 мы использовали более короткую версию (1 - 708) вместо полной ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM)	Научный центр Фишера	SH30022FS
Фетальная бычья сыворотка	Гиклон	SH30071
Пенициллин/стрептомицин	Научный центр Фишера	MP091670049
PolyJet	Научный центр Фишера	50-478-8 (английский)
Коктейль ингибиторов протеазы	Рош	11836153001
СТРЕП-Тактин Суперфлоу	Мба	2-1208-010 (Английский
Буфер для элюирования STREP-tag	Мба	2-1000-025 (Английский)
EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel	сигма	SLBQ1981V
Corning 100 мм × 20 мм стиль Чашка клеточной культуры обработанный непирогенный полистирол 20/рукав	Корнинг	430167
Протеин Lo-Bind Eppendorf	Научный центр Фишера	Тел.: 13-698-794
Цифровой вихревой микшер	Научный центр Фишера	Тел.: 02-215-370
Штатив для пенопласта на 48 отверстий	Научный центр Фишера	Тел.: 02-215-386
Шейкер Labquake гриль	термо	415110

)