$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Для настоящего исследования гибридный белок CVN-малый убиквитин-подобный модификатор (SUMO) был использован в иммуноферментных анализах вместо CV-N и подходит для клеточных анализов. Рекомбинантный полноразмерный белок HA H3 вируса гриппа А получают коммерчески (см. Таблицу материалов) или экспрессируют в клеточных линиях HEK293 млекопитающих и клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом, в соответствии со стандартными протоколами. Уханьский спайковый белок 1 экспрессируется в клетках HEK293 млекопитающих. Синтез мон-маннозилированного пептида (ММ) и ди-маннозилированного пептида (ДМ) позволяет обнаруживать гомогенные лиганды к CVN2 и мономаннозилированные малые молекулы.
1. Создание конструкций CV-N
- Для каждого из вариантов CVN2 и белка CVN2L0 (PDB ID 3S3Y) получить генную конструкцию с N-концевой последовательностью лидера pelB и His-меткой в векторе pET27b(+) из коммерческих источников (см. таблицу 1).
- Получить CVN2L0 и его варианты (V2, V3, V4 и V5; 1A,C) на фоне матричного гена CVN2L0, состоящего из двух различных последовательностей ДНК для каждого CV-N-повтора.
- Растворите лиофилизированную плазмидную ДНК в стерильной деионизированной дистиллированной воде (ddH2O) до конечной концентрации 100 нг/мкл.
2. Получение пластин LB-агара с клетками, преобразованными плазмидной ДНК
- Приготовьте питательную среду LB-Lennox, растворив 10 г/л пептона, 5 г/л дрожжевого экстракта и 5 г/л NaCl в ddH2O (см. Таблицу материалов), и отрегулируйте pH до 7,4. Проводят преобразование в компетентную E. coli BL21 (DE3) для каждого варианта (V2-V5) химическим методом в соответствии с ранее опубликованным отчетом.
- Расщепите раствор (900 мкл и 100 мкл), переложите 100 мкл на планшеты с ЛБ-агаром (50 мкг/мл канамицина) и аккуратно используйте стерильный распределитель клеток. Инкубируйте агаровые пластины в течение ночи при температуре 37 °C.
3. Клонирование
- Субклонировать ген CV-N в сайты NdeI и BamHI pET11a (см. Таблицу материалов) для трансформации (электропорации) в электрокомпетентные клетки в соответствии со ссылкой.
4. Сайт-направленный мутагенез
- Получить CVN2L0 и мутантный CVN-E41A на фоне матричного гена CVN2L0, содержащего две различающиеся последовательности ДНК для каждого CV-N-повтора.
- Проводите мутации с помощью набора для сайт-направленного мутагенеза (см. Таблицу материалов) и специфических мутагенных праймеров 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' и 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' для проведения ПЦР.
- Запустите серию реакций образца с использованием нескольких концентраций двухцепочечной матрицы ДНК (дцДНК) в диапазоне от 5 до 50 нг (например, 5, 10, 20 и 50 нг матрицы дцДНК). Поддерживайте постоянную концентрацию праймера.
заметка: Как правило, используется смесь ПЦР и протокол термоциклирования, как описано в инструкции к набору для сайт-направленного мутагенеза.
- Добавьте фермент рестрикции DpnI (1 μл, 10 Ед/μл, см. Таблицу материалов) под накладкой минерального масла. Тщательно и осторожно перемешайте реакции, открутите в настольной микроцентрифуге в течение 1 минуты и немедленно инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа для расщепления родительской суперспиральной дцДНК.
5. Трансформация бактериальных клеток
- Разморозьте сверхкомпетентные ячейки XL1-Blue (см. Таблицу материалов) аккуратно на льду. Чтобы преобразовать каждую реакцию контроля и образца, аликвотируйте сверхкомпетентные клетки (50 мкл) в предварительно охлажденную полипропиленовую пробирку с круглым дном (14 мл).
- Переносите 1 мкл обработанной Dpn I одноцепочечной ДНК (одноцепочечной ДНК) из каждой контрольной и выборочной реакции (мутированная одноцепочечная ДНК) в отдельные аликвоты сверхкомпетентных клеток, которые синтезируют комплементарную цепь. Осторожно перемешайте реакции превращения, перемешайте и инкубируйте реакции на льду в течение 30 мин.
заметка: Перед переносом обработанной Dpn I ДНК в реакцию трансформации рекомендуется тщательно удалить остатки минерального масла с наконечника пипетки. В качестве дополнительного контроля необходимо проверить эффективность трансформации сверхкомпетентных клеток XL1-Blue путем смешивания 0,1 нг/мкл контрольной плазмиды pUC18 (1 мкл) с 50 мкл аликвоты сверхкомпетентных клеток.
- Подайте тепловой импульс на реакции превращения при температуре 42 °C в течение 45 с, а затем поместите реакции на лед на 2 мин.<бр/>
заметка: Подаваемый тепловой импульс уже оптимизирован для указанных условий в полипропиленовых трубках с круглым дном (14 мл).
- Добавьте 0,5 мл бульона NZY+ (содержащего: 10 г NZ амина (гидролизата казеина), 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 12,5 мл 1 М MgCl2, 12,5 мл 1 М MgSO4, 10 мл 2 М глюкозы, pH 7,5 и предварительно подогретых до 42 °С) и инкубируйте реакции превращения при 37 °С с встряхиванием при 225-250 об/мин в течение 1 ч. Наберите правильный объем каждая реакция превращения (5 мкл от контрольного плазмидного превращения; 250 мкл от преобразования образца) на агаровых планшетах LB-ампициллина.
заметка: Для контроля трансформации и мутагенеза распределили клетки на LB-ампициллиновых агаровых пластинах, содержащих 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-gal, 80 мкг/мл) и изопропил-1-тио-β-D-галактопиранозид (IPTG, 20 мМ) (см. таблицу материалов). Инокулируйте 50 мл клеточных культур одной колонией трансформированных клеток E. coli для очистки мутировавшей плазмидной ДНК для анализа. Мутагенез подтверждается секвенированием ДНК на внешнем объекте.
6. Экспрессия и очистка белка
- Для крупномасштабной культуры инокулируйте небольшое количество LB (содержащего ампициллин) одной колонией из трансформированной пластины.
- Используя ночную культуру, инокулируйте культуру для экспрессии добавками, такими как 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4 и 20 мМ глюкозы, разбавляя культуру семян до 1/100.
- Выращивайте клетки с помощью энергичного встряхивания при 37 °C. Выращивайте клетки до Abs 600 нм в диапазоне 0,4-0,6 (средняя логарифмическая фаза) перед охлаждением клеток до 20 °C. Индуцируйте с помощью 1 мМ IPTG и выращивайте в течение ночи.
- Затем соберите клетки путем центрифугирования при 4000 x g в течение 15 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.
- Повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере с фосфатно-солевым буфером (PBS) и повторно центрифугируйте при 4000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Затем выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки. Суспендируйте оставшуюся гранулу в 10 мл буфера для лизиса и инкубируйте суспензию в течение 1 ч при 37 °C.
заметка: Состав буфера для лизиса: (50 мМ2PO4, 300 мМ NaCl, 2% Triton-X 100, 500 нг/мл лизоцима, 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мМ дитиотреитола, 1 мМ MgCl2, pH 8, см. таблицу материалов).
- Подвергните смесь двум циклам замерзания-оттаивания (-80 °C). Разделяют растворимые и нерастворимые фракции центрифугированием при 4000 х г в течение 15 мин при 4 °C и анализируют их с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), в частности, додецилсульфата натрия (SDS)-PAGE (рис. 1B, C).
заметка: Клетки могут быть лизированы несколькими способами, такими как замораживание-размораживание, ультразвуковая обработка, гомогенизация, ферментативный лизис или комбинация этих методов. Для получения высоких выходов белка рекомендуется очистка от включенных тел.
- Очистите белки с помощью колоночной хроматографии Ni-NTA (см. Таблицу материалов). Загрузите растворимую фракцию в колонку с регенерированными гранулами Ni-NTA (1 мл/мин). Промойте систему буфером TBS (50 мМ триса, 150 мМ хлорида натрия, pH 7,5) перед началом градиента (0-100% 500 мМ имидазола в TBS в течение 60 мин) и сбором фракций (1 мл/мин). Диализируйте очищенные белки для биохимической характеристики на уровне 100 мМ PBS (рис. 1C, D).
- В качестве альтернативы можно использовать аффинный гель His-Select Ni2+ (см. Таблицу материалов) в пробирках объемом 14 мл для связывания и ресуспендирования меченного им рекомбинантно экспрессированного CV-N в буферных растворах с 20 мМ имидазолом и 250 мМ имидазолом соответственно. Инкубировать партиями не менее 30 мин.<бр/>
заметка: Нанесите эти полуочищенные белки на одноразовую расфасованную колонку для буферного обмена и очистки биологических образцов, например, углеводов и белков, в которые можно загрузить 1-1,5 мл элюата из иммобилизованной металлической аффинной хроматографии.
- Перенесите белковые растворы в центрифугирующие пробирки с отсечным фильтром 10 кДа (см. Таблицу материалов) и сконцентрируйте их путем центрифугирования в течение 10 минут при 4 500 x g и 4 °C. Для измерения SPR замените растворы аналита на 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 3 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,05% Tween20, pH 7,4 (HBS-EP(+), см. Таблицу материалов).
- Добавьте этот рабочий буфер SPR с коэффициентом разбавления 1:10 и центрифугируйте четыре раза до исходного объема в течение 10 минут при 4 500 x g и 4 °C.
- Определите концентрацию белка на длине волны 280 нм с помощью спектрофотометра NanoDrop UV-Vis (см. Таблицу материалов) на основе рассчитанного коэффициента экстинкции (20 440 М-1 см-1) для основного белка CVN2L0, показывающего размер 23 474 Да. Используйте PBS (100 мМ, pH 7,0) или буфер SPR в качестве бланка и измерьте концентрацию белка на трех этапах разбавления (1:1, 1:10 и 1:100).
7. SPR спектроскопия
- Используйте двухканальную систему SPR (см. Таблицу материалов) с рабочим буфером HBS-EP(+) и 10 мМ глицина HCl pH 1,5-1,6 в качестве буфера для регенерации. Включите прибор, дегазатор, автопробник и насос и промойте всю систему с помощью ddH20 в течение 1 часа. Поместите готовый к использованию рабочий буфер в отдельную бутылку.
- Капните иммерсионное масло на детектор и установите стеклянный чип датчика (см. Таблицу материалов), покрытый тонкой золотой пленкой и функционализированный гидрогелем карбоксиметилдекстрана, с верхней стороны, непосредственно на детектор под трехпортовой проточной ячейкой. Исправьте настройку, потянув вниз handling.
заметка: C19RBDHC30M 200 нм стрептавидин дериватизированный карбоксиметилдекстран гидрогель со средней плотностью биотинилированного белка RBD тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса-2, представляет собой готовый к применению сенсорный чип с предварительно иммобилизованным лигандом.
8. Анализ связывания SPR для связывания CV-N с HA, S-белком и RBD
- Иммобилизуйте белковые лиганды к сенсорным чипам, выполнив следующие действия.
- Откройте таблицу выполнения, нажав на кнопку «Форма» в строке меню, и нажмите кнопку «Запустить редактор таблиц» в интегрированном программном обеспечении SPRAutoLink (см. раздел «Таблица материалов»). Выберите и нажмите на BASIC_Immobilization из списка доступных таблиц запуска и следуйте инструкциям экспериментальной процедуры на экране компьютера. Соответствующий используемый редактор образцов показан в правом верхнем углу.
- Нажмите на «Редактор наборов образцов» в разделе «Форма», чтобы заполнить список реагентов для двух штативов, размещенных в автосэмплере для дальнейших анализов. Нажмите на «Прямое управление автосэмплером» в качестве «Инструмента» в строке меню, чтобы переместить стойки вперед или обратно домой. Выберите рабочую температуру 4 °C.
заметка: Программное обеспечение SPR позволяет осуществлять "SPR Instrument Direct Control" и "Pump Direct Control" путем выбора соответствующих инструментов, а также работы с автосэмплером и нажатием кнопки "Form"; Также для выполнения анализа данных можно выбрать Run Table Editor, Data-Plot или Post-Processing. Файлы сохраняются непосредственно в каталоге по умолчанию и экспортируются как scrubber.files из окна постобработки.
- Запустите насос для вливания ddH20, нажав на Tools and Pump Direct Control, и запишите данные, нажав на SPR Instrument Direct Control, и каждый раз запускайте во вновь появившихся окнах. Поместите связывающие реагенты (шаг 8.3) во флаконы объемом 300 мкл, поместите их в штативы автосамплера и запустите таблицу прогона, нажав на кнопку Run.
заметка: Поверхности чипов либо кондиционируют 10 мМ глициновым буфером pH 9,0, либо, возможно, промывают 1 М натрия хлоридом, 0,1 М буфером бората натрия pH 9,0 для кондиционирования карбоксильной дериватизированной поверхности чипа для активации смеси EDC/NHS.
- Для этого простого белок-белкового взаимодействия используйте чип CMD500D (см. Таблицу материалов) для создания единицы микропреломления (μRIU) = 2500 - 3000 проточной ячейки с иммобилизованной HA и μRIU = 400 проточной ячейки с шиповидным белком. При скорости инфузии 15 мкл/мин введите водную и равномерную смесь 0,4 М N-этил-N'-(диметиламино пропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC*HCl) и 0,1 М N-гидроксисукцинимида (NHS), применяя следующие последовательные шаги.
- Заправьте насос со скоростью 25 000 мкл/мин, выполните регулировку исходного уровня в течение 30 с, введите 90 мкл раствора для активации образца (EDC/NHS) в течение 6 минут контакта, а затем удерживайте еще 5 минут.
- Повторите этот цикл после выполнения на исходном уровне в течение 1 минуты со скоростью 10 мкл/мин только на левой проточной ячейке (синей) для введения и иммобилизации химически синтезированных пептидов, ГК и спайкового белка в концентрации 20 мкг/мл, и дайте возможность последующей коррекции исходного уровня с помощью ddH2O в течение 1,5 мин перед закалкой активированной поверхности чипа 1 М этаноламина HCl pH 8,5.
- Переключите пробирки с пробоотборника жидкости на дегазатор с ddH20 в бутылку с HBS-EP(+) (Рисунок 2).
- Проанализируйте сенсорные граммы SPR.
- Для выполнения кинетических исследований используют различные концентрации аналитов (10-5-10-8 М), с этапом регенерации после каждого впрыска и холостыми измерениями после разных аналитов. Измените расход на 10 μл/мин и начните инъекции на 4 минуты контакта, затем 5 минут на базовую генерацию и две ступени регенерации по 2 минуты каждая с интервалом 30 с.
- Введите буферный раствор для холостых измерений, сенсорные граммы которых вычитаются из проб для нормализации различных концентраций белка.
- Нажмите на «Форму», прокрутите вниз и перейдите на «Постобработка», нажав на этот режим работы. Нажмите кнопку «Добавить», чтобы выбрать кривые привязки, созданные с течением времени в форме «График данных» для каждой ячейки потока, и экспортируйте наложение в виде файла скруббера (.ovr). Нажмите «Файл», чтобы открыть параметры сохранения файла. Получение кривых отклика путем выравнивания левой и правой кривых и вычитания сигналов второго опорного канала из сигналов лигандного канала.
заметка: Данные обрабатываются в режиме «Постобработки» путем определения сенсорных грамм вычислительным путем. Он помещается в наложение сенсорных грамм из левой и правой проточных ячеек, или представлен в виде сенсорграмм из разницы обоих каналов.
- Очистите всю жидкость 50-100 мМ глициновым буфером pH 9,5, водой и 20% этанолом до и после измерений связывания для удаления следов соли или любого белкового загрязнения, или более строгими, с 0,5% SDS и глицином.
заметка: Во избежание повреждения прибора рекомендуется проверить механическую стабильность стеклянной стружки перед повторной установкой чипового картриджа в прибор, если стружка хранилась в буфере или при 100% влажности.
Таблица 1: Кинетические данные, полученные из сенсорограмм SPR для связывания вариантов связи CVN2L0 и Cys-Cys V2, V4 и V5 с HA с использованием модели связывания Ленгмюра 1:1. KD [M] = koff/kon или kd/ka. Все данные генерируются при 25 °C в буфере HBS-EP(+).
| Аналит | kна [M-1*s-1] | kвыкл [S-1] | КД |
| CVN2L0 | 5.1 Э3 | 1.3 Э-3 | 255 нм |
| Версия 2 | 4.0 Е3 | 1.1 Э-3 | 275 нМ |
| Версия 4 | 1.2 Е3 | 1.3 Э-3 | 11 μМ |
| Версия V5 | 1.2 Е3 | 5.8 Э-2 | 5 мкМ |
