Ядерный магнитный резонанс для изучения белок-белковых взаимодействий на атомном уровне

Аннотация

Источник: Winkelaar, G., et al. Измерение взаимодействий глобулярных и нитевидных белков с помощью спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабного термофореза (МСТ). J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса для изучения белок-белковых взаимодействий между ¹⁵N-мечеными белками дикого типа и мутантными белками энвоплакина и немеченым белком виментином. Успешное взаимодействие энвоплакина дикого типа и виментина приводит к обширному уширению линии и исчезновению пиков в спектрах ЯМР, в то время как отсутствие взаимодействия между мутировавшим энвоплакином и виментином приводит к хорошо разрешенным пикам в спектрах ЯМР.

Протокол

1. Методы ЯМР

1. Подготовка образцов ЯМР
   1. Очистите ¹⁵N-меченых белков дикого типа или R1914E E-PRD с помощью 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ DTT, pH 7. Исходные растворы белка обычно находятся в диапазоне от 0,3 до 1 мМ с объемами около 1 мл.<бр/> заметка: Белок может быть концентрирован до >100 мкМ с помощью центробежного ультрафильтрационного устройства MWCO 3 кДа, 5 мл для доведения концентрации до подходящего диапазона для подготовки образцов.
   2. Очистите образец немеченого белка VimRod с помощью 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ DTT, pH 7.
   3. В конечный объем 500 мкл добавить белок дикого типа или мутантный белок E-PRD до конечной концентрации 100 мкМ, оксид дейтерия (D₂O) до конечной концентрации 10% (v/v) и DSS (4,4-диметил-4-силапентан-1-сульфокислоту) до конечной концентрации 20 мкМ. Довести объем образца до 500 мкл с помощью 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ DTT и pH 7. Репрезентативная подготовка образцов описана в таблице 1.
      заметка: Резонанс DSS 0 ppm используется для калибровки химических сдвигов ¹H, а также для косвенной привязки химических сдвигов ¹⁵N белка. D₂O используется для сигнала дейтериевого замка, чтобы спектрометр работал при постоянном суммарном магнитном поле.
   4. Составьте вторую пробу E-PRD, D₂O и DSS, как на предыдущем этапе, и добавьте VimRod до конечной концентрации 50 μM, прежде чем довести объем до 500 μL.
   5. Перенесите образцы объемом 500 мкл в ЯМР-пробирки шириной 5 мм для проведения эксперимента.

2. Экспериментальная установка ЯМР

1. Включите поток воздуха с помощью команды «ej», после чего образец будет поднят вверх от магнита. Теперь поместите образец в спиннер на вершине магнита за отверстие и вставьте его с помощью команды «ij». Подождите, пока образец остановится внутри магнита, прежде чем продолжить.
2. Создайте новый набор данных с помощью команды "edc" и загрузите стандартные параметры ЯМР ¹Н, выбрав эксперимент "ZGPR" (рисунок 1). Заполните поля NAME, EXPNO (номер эксперимента) и PROCNO (номер папки с обработанными данными). Выберите растворитель в поле "Set solvent" и нажмите "Execute 'getprosol'", чтобы прочитать стандартную головку зонда и параметры, зависящие от растворителя (prosol).
3. Заблокируйте образец на дейтерированном растворителе, т.е. D₂O, с помощью команды "lock" и дождитесь, пока он закончит подметание и достигнет блокировки.
4. Скорректируйте резонансную частоту магнита, настроив образец с помощью команды автоматической настройки "atma". Следите за кривой колебания до тех пор, пока автоматическая настройка не будет завершена.
5. Прокладка магнитного поля с помощью TOPSHIM (команда "topshim"). Шимминг — это процесс регулировки магнитного поля для достижения однородности вокруг образца. Хорошей практикой является сохранение значений оболочек совместимости с помощью команды "wsh" и их чтение с помощью "rsh" перед topshim, если используются те же или похожие примеры.
6. Отрегулируйте усиление приемника с помощью команды "rga" для достижения максимального соотношения сигнал/шум.
7. Поместите центр спектра на смещение водного резонанса (o1) и установите 90-градусный протонный импульс (p1) на высокую мощность с помощью "calibo1p1".
8. Соберите протонный спектр с помощью команды zero go "zg" и обработайте с помощью "efp", которая включает экспоненциальное умножение ("em"), затухание свободной индукции (FID) с уширением линии, преобразование Фурье "ft" FID и "pk" для применения фазовой коррекции.
9. Примените автоматическую фазовую коррекцию "apk" и автоматическую базовую коррекцию "absn" с помощью полинома без интегрирования.
10. Создайте новый набор данных (как в разделе 1.2.2) для эксперимента SOFAST HMQC, выбрав в эксперименте "SFHMQC3GPPH".
11. Скопируйте оптимизированные P1 и O1 из протонного спектра и заполните P1-зависимые импульсы с помощью команды "getprosol 1H p1 plw1", где p1 - оптимизированное значение P1, а plw1 - уровень мощности для P1.
12. Оптимизируйте константу CNST54, чтобы задать смещение для химического сдвига амида, и CNST55, чтобы определить ширину полосы, чтобы охватить спектральные области интереса, что позволяет оптимизировать усиление приемника (рис. 2). Чтобы выбрать эти параметры, извлеките из двумерного спектра первый FID (затухание свободной индукции) и найдите наблюдаемый сигнал для их определения. Кроме того, изменяйте задержку релаксации (D1), количество сканирований (NS) и фиктивных сканирований (DS) для получения приемлемой чувствительности сигнала с помощью команды «gs», которая позволяет go and scan контролировать качество данных в режиме реального времени.
13. Запишите спектры с помощью Zero Go "zg".

Таблица 1. Подготовка образцов ЯМР.

образец	1 мМ E-PRD в буфере A (μL)	1 мМ VimRod в буфере A1 (μL)	Буфер А (μл)	200 мкМ DSS в D2O (μL)	Буфер B2 (μL)	Общий объем (μл)
Только E-PRD	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Буфер A: 20 мМ Tris-HCl, 1 мМ DTT, pH 7
2Буфер B: 23 мМ Tris-HCl, 1.14 мМ DTT, pH 7

Результаты

Рисунок 1: Скриншот установки эксперимента ЯМР. Показанное окно используется для настройки стандартного эксперимента по сбору набора данных HSQC. Параметры эксперимента считываются рядом с параметром Experiment. Показанный эксперимент ZGPR выбран в качестве начального эксперимента для загрузки стандартных и зависящих от растворителя параметров протонов. Окно «Заголовок» используется для ввода сведени...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Хлорид аммония (15N, 99%)	Кембриджская изотопная лаборатория	НЛМ-467	Мечение изотопов для ЯМР
D2O, оксид дейтерия (D, 99,8%)	Кембриджская изотопная лаборатория	ДЛМ-2259	Подготовка образцов ЯМР
DSS, Натрий 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат-D6 (D,98%)	Кембриджская изотопная лаборатория	ДЛМ-8206	Справочная информация по ЯМР
Прецизионные ЯМР-трубки 5 мм, длина 7 дюймов	SJM/Deuterotubes	БОРОЭКО-5-7	ЯМР-трубки
ЯМР-спектрометр (14,1 Тесла)	Брукер		Сбор данных ЯМР
Криогенный зонд TCI 5 мм z-PFG	Брукер		Сбор данных ЯМР
программное обеспечение
Bruker TopSpin 4.0.1	Брукер		Обработка данных ЯМР