Использование фагового дисплея для выбора белков с высоким сродством к белку-мишени

Аннотация

Источник: Zhang, W., et al., Использование фагового дисплея для разработки модуляторов убиквитиновых вариантов для E3-лигаз. J. vis. Exp. (2021)

В этом видео мы демонстрируем технику фагового дисплея для выделения предварительно сконструированных фагов, экспрессирующих белки с высоким сродством к белку-мишени.

Протокол

1. Подготовьте библиотеку фагов

1. Разморозьте библиотеку фагов на льду и разбавьте ее до 100-кратного разнообразия библиотеки в PBS. Например, если библиотечное разнообразие равно 1 x 10¹⁰, а библиотечная концентрация равна 1 x 10¹³, разбавьте библиотеку так, чтобы концентрация была 1 x 10¹². Для используемых здесь библиотек разбавьте их в PBS в 10 раз, объединив 1 мл библиотеки с 9 мл PBS.
   заметка: Библиотечное разнообразие должно быть определено во время создания библиотеки и не может быть легко оценено иным образом. Библиотечную концентрацию можно определить, инокулируя клетки E. coli в середине логарифмической фазы (OD600 0,6 - 0,8) и осаждение на LB/carb.
2. Добавьте 1/5 объема PEG/NaCl. Например, на 10 мл ранее разведенной библиотеки добавьте 2 мл PEG/NaCl.
3. Выдерживать на льду в течение 30 минут.
4. Центрифугируйте при 11 000 x g в течение 30 минут при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно центрифугируйте в течение 2 минут, чтобы удалить оставшуюся надосадочную жидкость><. заметка: Поместите трубку в ротор в ту же ориентацию во второй раз, так как она была первой, чтобы держать гранулу на том же месте, тем самым облегчая обзор.
5. Аккуратно ресуспендируйте фаговую гранулу в 1 мл PBT на белок. Для четырех белков ресуспендируйте гранулу в 4 мл PBT.
   заметка: Старайтесь не прикасаться к грануле и не вводить пузырьки воздуха.

2. Отображение фага на целевой белок(ы)

1. Дополнительное управление: Добавьте 100 мкл фаговой библиотеки в каждую лунку с покрытием в контрольной пластине. Инкубируйте при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч при орбитальном встряхивании со скоростью 300 об/мин и перенесите библиотеку с контрольной пластины на целевую пластину.
2. Удалите PB-буфер с целевой пластины и добавьте 100 мкл фаговой библиотеки в каждую лунку с покрытием.
3. Инкубировать при комнатной температуре (~20-25 °C) в течение 1 ч при встряхивании орбиты со скоростью 300 об/мин.

3. Элюирование вокруг одного фага

1. Извлеките фаговую библиотеку и четыре раза промойте лунки с покрытием PT-буфером. Переверните тарелку и постучите по бумажному полотенцу, чтобы удалить последние капли.
   заметка: Если на одной пластине покрыто несколько целевых белков, постарайтесь свести к минимуму поступление всех последующих растворов между лунками.
2. Добавьте 100 мкл 0,1 М HCl в каждую лунку с покрытием и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин при орбитальном встряхивании со скоростью 300 об/мин.
3. Нейтрализуйте pH, добавив 12,5 мкл 1 М Tris-HCl (pH 11) в каждую лунку с покрытием.
4. Объедините элюированный фаг из всех 8 лунок в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Пипеткой вверх и вниз во время перекачки сделайте растворы однородными и отсасывайте всю жидкость из лунок.
5. Добавьте 10% BSA в объединенный элюированный фаг до конечной концентрации 1%. Для типичного круглого объема элюирования 950 мкл добавьте 95 мкл 10% BSA. Хранить при температуре 4 °C. Это круглый выход.

4. Подготовка к последующим раундам отбора

1. Подготовьте посевную культуру для культивирования фагового ввода для следующего раунда отбора, как показано на шаге 1.1.
2. Покройте пластину для третьего раунда отбора, как в шаге 1.2, с изменениями, указанными ниже.
   1. Покрывайте только четыре лунки на белок в 96-луночной связующей пластине. Используйте половину содержимого пробирок «круглая 2/3» или «круглая 4/5» для соответствующего круга. Разбавляйте содержимое этих пробирок по мере необходимости, чтобы избежать оседания белков из раствора.
3. Подготовьте фаговый вход для следующего раунда выбора.
   1. Используйте половину выхода круглого 1 для инокуляции 3 мл клеток со средней логарифмической фазой. Для типичного круглого первого выхода закиньте 500 мкл выхода.
   2. Инкубировать при температуре 37 °C в течение 30 минут при встряхивании орбиты со скоростью 200 об/мин.
   3. Добавьте вспомогательный фаг M13K07 до конечной концентрации 1 x^{10 10} БОЕ/мл.
   4. Инкубировать при 37 °C в течение 1 ч с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин.
   5. Перенесите все 3 мл культуры в 30 мл 2YT/carb/kan. Выращивайте в течение ночи при температуре 37 °C с орбитальным встряхиванием со скоростью 200 об/мин.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Axygen Mini Tube System (0,65 мл, стерильный, 96/штатив, 10 штативов/упаковка)	Научный центр Фишера	14-222-198	Пластиковая посуда
Обезвоженные питательные среды BD Difco: бульон LB, Миллер (Лурия-Бертани)	Научный центр Фишера	ДФ0446-17-3	Подготовка пластин к титрованию
Бычий сывороточный альбумин (БСА), фракция V	BioShop Канада	АЛБ001	Буферный компонент
Карбенициллина динатриевая соль 89,0-100,5% безводная	Миллипор-Сигма	С1389-5Г	Культивирование клеток, инфицированных фагемидами
Компактный цифровой шейкер для микропланшетов	Научный центр Фишера	Тел.: 11-676-337	устройство
Алюминиевая уплотнительная лента Corning Microplate	Научный центр Фишера	Тел.: 07-200-684	Герметизация фаговых глицериновых акций
Обезвоженный агар	Научный центр Фишера	ДФ0140-01-0	Подготовка пластин к титрованию
DS-11 Спектрофотометр/флуориметр	DeNovix	DS-11 FX+	устройство
Greiner Bio-One CellStar 96-луночный, необработанный, с U-образным дном микропланшет	Научный центр Фишера	7000133	Пластиковая посуда
соляная кислота	Научный центр Фишера	А144-500	химический
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Химически компетентная кишечная палочка	Научный центр Фишера	C854003	Штамм бактерий при фаговой инфекции
Канамицина сульфат	Научный центр Фишера	AAJ1792406	Культивирование фаговых клеток-хелперов M13K07
M13KO7 Вспомогательный фаг	Биолаборатории Новой Англии	Н0315С	Разрешить упаковку фагемидов и секрецию
MaxQ 4000 Настольный орбитальный шейкер	Научный центр Фишера	Тел.: 11-676-076	устройство
96-луночный микропланшет Nunc MaxiSorp, плоское дно	Технологии Life	Телефонный номер 44-2404-21	Пластиковая посуда
Фосфатно-солевой буфер (PBS) 10X раствор	Научный центр Фишера	БП3994	Буферный компонент/фаговая ресуспензионная среда
Полиэфирные пленки для ИФА и инкубации	ВВР	60941-120	Укрытие микропланшетов во время инкубации
Полиэтиленгликоль 8000 (ПЭГ)	Научный центр Фишера	БП233-1	Фаговое осаждение
Хлорид натрия	Миллипор-Сигма	С3014	Фаговое осаждение
Стерильные пластиковые пробирки для культивирования: полупрозрачный полипропилен	Научный центр Фишера	14-956-1Д	Культивирование фаговых входов
Тетрациклина гидрохлорид	Научный центр Фишера	БП912-100	Культивирование клеток E. coli OmniMax
База Трис	Научный центр Фишера	БП1525	Нейтрализация элюированного фагового раствора
Порошок триптона	Научный центр Фишера	БП1421-2	Компонент клеточной питательной среды
Подросток 20	Научный центр Фишера	BP337500	Буферный компонент
Дрожжевой экстракт	Научный центр Фишера	БП1422-2	Компонент клеточной питательной среды