1. FKBP12 F36V -mVenus Purification
- Трансформируйте (DE3) pLysS-клетки вектором pET22b, содержащим мономеризованные FKBP12F36V12 человека и N-концевые метки His6 и mVenus (вектор предоставляется по запросу). Пластинчатые клетки на LB агар с добавлением ампициллина 50 мкг/мл и хлорамфеникола 34 мкг/мл.
- Пересадите преобразованные колонии в 100 мл LB закваски и выращивайте в течение 16 - 20 часов при 37 °C с встряхиванием.
- Плотную закваску развести (OD600 >1) 1:100 в LB среде (2 x 500 мл партии) и выращивать в течение 2 - 3 часов до OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 об/мин).
- Остудить культуры на льду. Индуцировать с 250 мкМ IPTG и выращивать в течение 16 - 20 часов при 21 °C, 200 об/мин.
- Соберите клетки центрифугированием при давлении 2 000 x g в течение 20 минут.
- Ресуспендируйте гранулу в 40 мл IMAC буфера А (20 мМ натрия фосфата pH 7,5, 500 мМ NaCl, 3 мМ имидазола, 1 мМ β-меркаптоэтанол) с добавлением ингибиторов протеазы, не содержащих ЭДТА (1 таблетка на клеточную гранулу).
- Ультразвуковые элементы (500 Вт, 20 кГц, амплитуда 40%, 9 с включено, 11 с выключено в течение 15 минут) на льду и собирают растворимый материал центрифугированием при температуре 20 000 x g.
- Переложите растворимый лизат в коническую колбу и добавьте 2 мл смолы (см. Таблицу материалов). Инкубация в течение 1 часа при обороте 105 об/мин
заметка: Никелевая сефароза также может быть использована для этой стадии IMAC.
- Соберите смолу и промойте 250 мл буфера IMAC A, а затем 500 мл буфера IMAC B (20 мМ фосфата натрия pH 7,5, 500 мМ NaCl, 7 мМ имидазола, 1 мМ β-меркаптоэтанола).
заметка: Увеличьте до 50 мМ имидазол при использовании никелево-сефарозной смолы.
- Элюируйте белок, меченный His6, с помощью буфера C IMAC (20 мМ фосфата натрия pH 7,5, 500 мМ NaCl, 300 мМ имидазола, 1 мМ β-меркаптоэтанол).
- Вводите в колонку исключения размера (см. Таблицу материалов), уравновешенную в 10 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl и 1 мМ DTT. FKBP12F36V имеет пик элюирования на уровне 87,71 мл на колонке, которую мы использовали.
- Оцените чистоту с помощью SDS-PAGE и при необходимости объедините и сконцентрируйте.
2. Подготовка массива многолуночных пластин
- Разморозьте очищенный FKBP12F36V (или меченый белок, представляющий интерес) при температуре -80 °C.
- Приготовьте раствор из 100 нМ очищенного FKBP12F36V (среда, 10 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT). Ультразвуковая обработка и центрифуга (быстрый отжим 13 000 об/мин) для предотвращения образования заполнителей.
- Пипетка 100 - 200 мкл в 8-луночную камеру наблюдения со стеклянным дном.
- Добавьте димеризатор BB до конечных концентраций 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 и 500 нМ.
- В качестве образца подготовьте раствор только на 100 нМ mVenus для оценки потенциальных эффектов агрегации и осаждения и восстановления значения яркости для мономера с теми же настройками регистрации.
3. Конфокальный сбор данных без калибровки
- Запустите конфокальную систему (рисунок 1). Подойдет любая конфокальная система светового сканирующего микроскопа, оснащенная цифровыми детекторами или хорошо охарактеризованными аналоговыми детекторами и способная поддерживать постоянное время пребывания для каждого полученного пикселя.
- Задайте траекторию луча возбуждения:
- Включите лазер с длиной волны 514 нм и установите его на 20 - 100 нВт на выходе из объектива (для FKBP12F36V-mVenus).
- Выберите объектив 63X1.4NA или объектив для коррекции воротника для погружения в воду, предназначенный для FCS.
- Включите один детектор HyD, APD или откалиброванный ФЭУ. Предпочтительны детекторы, способные подсчитывать фотоны, так как в этом случае вычисление S, смещения и σ02 не требуется.
- Выберите окно излучения от 520 - 560 нм
- Установите отверстие на 1 единицу Airy для соответствующего излучения ~545 нм.
- Установите режим съемки на 16 x 16 пикселей
- Установите время задержки пикселя tdwell таким образом, чтобы оно удовлетворяло tкадру >> TD >> tdwell, где TD — время пребывания диффундирующего белка, а tframe — частота кадров. Это соответствовало установке времени задержки ~13 μс.<бр/>
заметка: У некоторых коммерческих производителей были сканеры, которые не поддерживали постоянное время задержки на пиксель. Это постоянство имеет решающее значение для работы метода.
- Установите размер пикселя на ~120 нм.
- Выберите режим сбора данных xyt и выберите количество кадров, которые должны быть получены для одного захвата и скважины (например, 5 000).
- Если система оснащена высокопроизводительным режимом, введите координаты каждой скважины и количество заборов на скважину для автоматизации процесса.
заметка: Будьте внимательны, чтобы убедиться в наличии диспенсера для воды, если вы используете объектив для погружения.
- Если система оснащена системой перфузии, загрузите раствор BB и запрограммируйте перфузию на начало сразу после 5000-го кадра, чтобы оценить кинетику димеризации при получении, например, 10 000 изображений.
- Добавьте каплю масла в мишень для погружения в масло/воду, если вы используете меру для коррекции воротника, предназначенную для FCS.
- Смонтируйте на сцене 8-луночную камеру наблюдения.
- Выберите правильную скважину и сосредоточьтесь на решении.
заметка: ВАЖНО: Избегайте фокусировки близко к нижнему стеклу, чтобы избежать отражения и рассеяния. При более глубокой фокусировке в растворе отключите опцию автоматической фокусировки.
- Запустите получение изображения и сохраните полученную стопку изображений в формате TIFF.
4. Анализ тренда и яркости с помощью пакета R nandb
- В качестве предварительной проверки качества используйте ImageJ для просмотра изображений и восстановления профиля интенсивности, как показано на рисунке 2a. Это полезно для определения того, произошло ли слишком сильное фотообесцвечивание. Если обесцвечивание слишком сильное, данные не пригодны для дальнейшего анализа.
заметка: ImageJ также может быть полезен для конвертации изображений в TIFF из коммерческих форматов. Описанное ниже программное обеспечение nandb может работать только с файлами TIFF.
- Загрузите и установите R и RStudio. Лучше всего сначала скачать и установить R, затем RStudio.
заметка: Далее следует описание того, как использовать пакет nandb R. Для использования nandb не требуется знание языка R, однако, это облегчит жизнь.
- Установите пакет nandb.
- Откройте RStudio и в консоли введите install.packages("nandb") и дождитесь установки.
- Познакомьтесь с nandb
- Ознакомьтесь с инструкцией.
- Ознакомьтесь со встроенной справкой RStudio для различных функций. Наиболее вероятной функцией, которая будет использоваться, будет brightness(). Чтобы просмотреть файл справки для этой функции, введите ? brightness() на консоли.
- Рассчитать яркость
- Скажем, у вас есть файл изображения на рабочем столе под названием img001.tif (обратите внимание, что nandb работает только с файлами TIFF). Можно рассчитать яркость этого изображения:
b <- яркость("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
- Это присваивает яркость изображения переменной b в R. Тау = "auto" гарантирует, что изображение будет правильно удалено до вычисления яркости. Чаще всего здесь можно рассчитать среднюю или медианную яркость изображения. Это можно сделать, набрав mean(b) или median(b). Также можно записать изображение яркости на рабочий стол с помощью
ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- Скажем, у вас есть папка, полная изображений, images_folder на рабочем столе, и вам нужно рассчитать яркость этих изображений и записать изображения яркости в виде файлов TIFF. Тогда см. ?brightness_folder(). Эта функция обрабатывает всю папку сразу:
brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
Это особенно хорошо для тех, у кого есть программное обеспечение, которое они предпочитают R, потому что все файлы обрабатываются одной единственной командой, а затем можно продолжить работу с выводом яркости изображений TIFF в выбранном ими программном обеспечении, будь то ImageJ, Python или что-то еще.
