$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Клонирование
- Определите конфигурации для клонирования и выберите компоновщик. Пометьте белки фрагментами на N- или C-конце, как описано ниже, чтобы они не нарушили их правильную локализацию. Используйте гибкий компоновщик, такой как (GGGGS)x2.
- Генетически пометить белки, представляющие интерес для фрагментов PAmCherry1. В качестве одного из вариантов можно использовать клонирующие плазмиды, перечисленные в Списке материалов, содержащих фрагменты RN (остатки PAmCherry1 1-159) и RC (Met плюс остатки PAmCherry1 160-236) с фланкирующими последовательностями MCS.
- Линеаризовать плазмиды, содержащие фрагменты RN и RC, с помощью обратной ПЦР (или рестрикционного дайджеста) в месте введения. Праймеры для обратной ПЦР перечислены в таблице 1. Ниже приведен пример протокола ПЦР, используемого в лаборатории автора (точные материалы, использованные в этом протоколе, см. в Списке материалов).
- Смешайте реакцию ПЦР, доведя до конечного объема 50 мкл с водой: в тонкостенную ПЦР-пробирку добавьте воду, 25 мкл 2x мастер-смеси, по 0,5 мкл каждого из прямых и обратных праймеров (20 мкМ разбавленного исхода, 0,2 мкМ конечной концентрации) и 1 нг матрицы. Используйте следующие условия цикла: 98 °C в течение 30 секунд, 30 циклов при 98 °C в течение 7 секунд и 68 °C в течение 2 минут и окончательное продление при 72 °C в течение 10 минут.
- ПЦР гены, представляющие интерес, для встраивания в линеаризованные плазмиды, содержащие фрагменты RN и RC. Проведите ПЦР как на шаге 1.2.1 с временем продления при 68 °C. Используйте праймеры с выступами, которые содержат гибкую последовательность линкеров, такую как GGAGGTGGAGGTGGTGGTGGGTGGAAGT для (GGGGS)x2, и гомологию 15 пар оснований на концах линеаризованной RN и RC плазмид для рекомбинации.
заметка: Выступы праймеров для представляющих интерес белков представлены в таблице 2 при использовании праймеров из таблицы 1 для линеаризации плазмидного скелета.
- Расщепите реакцию ПЦР с Dpn1 для исключения шаблона ПЦР. Добавьте 0,5 мкл Dpn1 (20 Ед/мкл) непосредственно в 50 мкл ПЦР-реакции. Инкубировать при 37 °C в течение 1 часа и нагревать при 80 °C в течение 20 минут. Если фоновый шаблон сохраняется на более поздних этапах, увеличьте количество фермента или удлините время переваривания.
- Очистите продукты ПЦР с помощью спиновой колонки в соответствии с описанием производителя.
- Проведите независимую от лигирования реакцию для объединения линеаризованной плазмиды, содержащей фрагмент RN или RC, с интересующим геном. Измерьте концентрацию очищенных продуктов ПЦР: соедините 50 нг линеаризованной плазмиды и 50 нг интересующего гена с 1 мкл ферментного премикса и доведите общий объем до 5 мкл с деионизированной водой. Инкубировать при 50 °C в течение 15 минут, положить на лед и добавить 20 μл TE-буфера.
- Превращайте рекомбинантные плазмиды в компетентные бактерии.
- Выберите 2-4+ (по желанию) колонии для O/N культуры. Добавьте 5 мл бульона LB и 5 μл канамицина (бульон 50 мг/мл) в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 14 мл и добавьте выбранную колонию бактерий с помощью стерилизованной инокуляционной петли. Инкубировать при 37 °C O/N при встряхивании при 225 об/мин.
- Заморозьте 1 мл O/N культуры для глицеринового бульона и подготовьте оставшуюся часть в соответствии с описанием производителя.
- Выполните секвенирование, чтобы определить хороший клон. При использовании клонирующих плазмид из Перечня материалов используйте прямые и обратные праймеры M13 (в отдельных реакциях) по мере необходимости для получения полной последовательности конструкции слияния. Сравните с ожидаемой последовательностью с помощью инструмента выравнивания, такого как BLAST от Национального центра биотехнологической информации (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Перенос проверенных последовательностей конструкций в экспрессирующую плазмиду с помощью реакции рекомбиназы.
- Добавьте 75 нг плазмиды назначения, такой как pcDNA для транзиторных трансфекций или pLenti для упаковки лентивирусов, и 50 нг рекомбинантной клонирующей плазмиды к 1 мкл ферментного премикса и доведите общий объем до 5 мкл с помощью деионизированной воды. Инкубировать при 25 °C в течение 1 часа, затем добавить 5 μл TE буфера.
заметка: Для упаковки лентивирусов и стабильного образования клеточной линии используйте разные плазмиды назначения для каждой конструкции, например, одну с устойчивостью к пуромицину, а другую с неомицином. Это позволяет осуществлять двойной отбор трансдуцируемых клеток. Также рассмотрите промотор для каждого из них, например, промотор конститутивного цитомегаловируса (ЦМВ) для высоких уровней экспрессии или ЦМВ с оператором TetO для настраиваемой экспрессии, регулируемой доксициклином.
- Преобразуйте 5 мкл в компетентные бактерии и подготовьте плазмиды в соответствии с шагами с 1.2.6 по 1.2.8, но с использованием соответствующего антибиотика (обычно ампициллина).
- Определите оптимальную конфигурацию BiFC.
- Котрансфектируйте экспрессирующие плазмиды в клетки U2OS (или клетки по выбору).
- Добавьте 350 μл фенола без красных и антибиотиков DMEM с добавлением 10% FBS в каждую лунку 8-луночного предметного стекла со стеклянным дном #1,5. Планшет примерно 7,5 х 10 4 клетки на лунку, чтобы клетки сливались примерно на 70%-90% на следующий день.
- На следующий день после нанесения покрытия в каждую лунку проводят сотрансфектную экспрессию плазмид различной конфигурации с использованием предпочтительного реагента и в соответствии с описанием производителя.
- В каждую лунку добавьте по 125 нг каждой экспрессирующей плазмиды в 50 мкл восстановившейся среды без сыворотки в пробирку объемом 0,6 мл и перемешайте пипеткой вверх и вниз. Добавьте 1 мкл реагента для трансфекции вниз по центру пробирки и непосредственно в среду. Осторожно перемешайте и оставьте на 30 минут.
- Уменьшите содержание среды в каждой лунке камеры предметного стекла примерно наполовину. Добавьте трансфекционную смесь по каплям в лунки и осторожно встряхните, чтобы перемешать. Инкубируйте клетки при 37 °C и 5%CO2 в течение 24-48 часов. Смените носитель на следующий день после переработки.
- Изображение клеток на флуоресцентном микроскопе, как в Протоколе 2, начиная с шага 2.1.4.
заметка: Образец может быть визуализирован на стандартном флуоресцентном микроскопе, если уровни экспрессии высоки и камера достаточно чувствительна для относительно низкого фотонного выхода PAmCherry1. Восстановленные молекулы PAmCherry1 могут быть активированы с помощью набора ультрафиолетовых фильтров (405 нм) перед визуализацией с помощью набора фильтров зеленого возбуждения (561 нм).
- Там, где это применимо, создайте отрицательный контроль, например, путем введения точечной мутации в один из представляющих интерес белков, которые нарушают взаимодействие. Проведите сайт-направленный мутагенез на клонирующей плазмиде мутируемого белка выбранной конфигурации.
- Создайте стабильную клеточную линию, упаковав конструкции в вирусные частицы и заразив клетки U2OS (или клеточную линию по выбору). Рассмотрите возможность использования индуцируемой (тетрациклиновой) системы экспрессии, чтобы экспрессия могла быть индуцирована до визуализации, если существует проблема длительной необратимости BiFC или если желательна настраиваемая экспрессия.
осторожность: Работа с вирусами относится к уровню биобезопасности 2. Несмотря на то, что последние поколения вирусных упаковочных систем значительно снизили вероятность производства вирусов, способных к репликации, некоторые риски все еще присутствуют. Ссылки можно найти по адресу http://www.cdc.gov/ biosafety/publications/.
- Повторите шаг 1.2.10 с использованием ленти- или ретровирусного вектора назначения. Увеличьте культуру O/N до 100 мл для получения мидипрепа и большей чистоты плазмид.
- День 1: Поместите примерно 2 x 106 293T/17 клеток в чашку диаметром 10 см для каждой конструкции, которую нужно упаковать.
- День 2: Приготовьте реакцию трансфекции с использованием реагента для трансфекции по выбору и в соответствии с описанием производителя.
- Приготовьте премикс упаковочных плазмид с конечными концентрациями 250 нг/мкл для упаковки плазмид 1 и 2 и 100 нг/мкл для упаковки плазмиды 3 в стерильной воде. Добавьте 10 μл упаковочной плазмидной предварительной смеси и 2,5 μг целевой плазмиды в 1 мл восстановленной среды, не содержащей сыворотки, в полипропиленовую пробирку с круглым дном объемом 5 мл и пипеткой вверх и вниз для смешивания. Добавьте 20 μл трансфекционного реагента вниз по центру пробирки и непосредственно в среду.
- Осторожно перемешайте и инкубируйте при RT в течение 30 мин. Удалите около половины среды из клеток и добавьте трансфекционную смесь по каплям. Осторожно встряхните, чтобы перемешать, и инкубируйте при 37 °C и 5%CO2. Инкубируйте по 10 мл среды на планшет в пробирке с ослабленной крышкой для уравновешивания температуры и CO2.
- День 3: Аккуратно поменяйте среду на предварительно инкубированную среду и верните клетки в инкубатор. Инкубируйте еще одну пробирку с фильтрующим материалом с закрытой крышкой. Примечание: Синцития, или образование больших многоядерных клеток, может быть признаком того, что упаковка идет хорошо. Тем не менее, клетки находятся в хрупком состоянии и могут быть легко отделены. При смене носителя наклоните пипеттор так, чтобы он был горизонтальным, и добавляйте фильтрующий материал по каплям в один край пластины.
- День 4: Соберите вирус, удалив среду с помощью шприца и отфильтровав через фильтр размером пор 0,45 мкм в чистую пробирку объемом 50 мл. Аккуратно замените среду на предварительно инкубированную.
- День 5: Соберите урожай снова, как было сделано ранее на шаге 1.5.3.3, и смешайте общий фильтрат в той же пробирке объемом 50 мл. Добавьте по 6 мл концентратора вирусов в каждую пробирку и перемешайте. Хранить при температуре 4 °C не менее 24 часов, пока вирус не выпадет в осадок.
заметка: В зависимости от здоровья клеток, вирус может быть собран в третий раз.
- Сконцентрируйте вирус путем центрифугирования при 1 500 x g в течение 15 мин при 4 °C. Отсадите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 250 мкл среды. Вирусы можно использовать немедленно для лечения инфекции или хранить в аликвотах объемом 50 мкл при -80 °C в течение одного года.
- Поместите около 3 x 105 клеток U2OS (или мишеней) в лунку в 6-луночный планшет (2 мл DMEM с 10% FBS на лунку) для инфекции, чтобы клетки были примерно на 50% слитыми в момент инфекции.
- На следующий день удалите примерно половину среды, чтобы осталось около 1 мл. Коинфицируйте 50 мкл концентрированного вируса для каждой конструкции. Добавьте в каждую лунку по 1 мкл полибрена (8 мг/мл). Инкубировать при 37 °C и 5%CO2. Смените среду на следующий день и инкубируйте еще один день перед выбором антибиотика.
заметка: Количество добавляемого вируса может варьироваться в зависимости от желаемой скорости заражения. Вирусы можно титровать с помощью qRT-PCR.
- Добавьте антибиотики для отбора зараженных клеток. Отдельные лунки с неинфицированными клетками, которые не видели вирус, требуются в качестве канареек для проверки эффективности отбора. Выдерживать в течение 2-7 дней или до завершения отбора.
заметка: Эффективные концентрации следует титровать изначально, но обычно они составляют 1,0 мкг/мл для пуромицина и 1,0 мг/мл для неомицина.
- Разверните ячейки в большую 10-сантиметровую тарелку и перейдите к протоколу 2.
2. Визуализация фиксированных клеток
- Подготовка образца к визуализации
- Очистите предметное стекло камеры со стеклянным дном на 8 лунок #1.5, добавив 250 мкл 1 М NaOH в течение не менее 1 часа, и тщательно промойте PBS.
заметка: Необработанные предметные стекла камеры обычно приводят к высокому фоновому сигналу. Кроме того, элементы могут быть чувствительны к остаточному NaOH, и отсутствие тщательной очистки поверхности стекла (до 10 промывок) может затруднить адгезию элемента. При необходимости после промывки инкубируйте очищенное предметное стекло камеры с PBS O/N. Для чувствительных клеточных линий может помочь осаждение с более высокой плотностью (например, с начальной конфлюенсацией 50%-60%).
- Планшет примерно 5,5 x 104 стабильных экспрессирующих клеток U2OS в лунке в 350 мкл фенола без красных DMEM с 10% FBS, чтобы клетки были здоровыми и не сливались слишком много при визуализации.
- Выполните необходимые для эксперимента процедуры, такие как добавление тетрациклина для стимуляции экспрессии белка.
- Зафиксируйте клетки непосредственно перед визуализацией.
- Перед фиксацией готовят свежий раствор параформальдегида (ПФА) — 3,7% ПФК в 1х ПФМ с 0,1% глутарового альдегида (ГА). Для 10 мл раствора PFA взвесьте 0,37 г PFA и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл дистиллированной воды и 30 мкл 1 М NaOH и вортекс. Нагревайте до 70 °C и делайте вихри каждые 1-2 минуты до полного растворения PFA.
- Перелейте растворенную PFA в коническую пробирку объемом 15 мл и добавьте 3,8 мл дистиллированной воды, 5 мл 2x буфера PHEM, 20 мкл 25% глутаральдегида и вортекс для смешивания. Стоковый, 2x PHEM буфер 120 мМ PIPES, 50 мМ HEPES, 20 мМ EGTA и 16 мМ MgSO4, с pH регулируемым до 7,0 с 10 М KOH. Этот фиксирующий раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких дней><.
осторожность: PFA и GA опасны. Приготовьте раствор в вытяжном шкафу и надевайте надлежащие средства защиты при работе с обоими химическими веществами. Избегайте ингаляций и прямого контакта с кожей.
- Удалите питательную среду. Быстро промойте 500 мкл PBS и добавьте 250 мкл фиксатора PFA на лунку. Инкубируйте клетки в течение 20 минут при RT.
- Удалите фиксатор PFA из образца и добавьте 350 мкл PBS или буфера для визуализации (100 мМ Tris с 30 мМ NaCl и 20 мМ MgCl2, pH 8,5) в лунку.
- Вихревые частицы золота размером 100 нм для разрушения агрегатов и добавление 35 μл на лунку (10-кратное окончательное разбавление) для отслеживания дрейфа стадии во время визуализации.
- Получение изображений
- Включите микроскоп. Включите лазеры 405 и 561 нм, но держите затворы (внутренние или внешние) закрытыми на этом этапе. Включите камеру EMCCD и дайте ей остыть. Убедитесь, что фильтры с длиной волны 561 нм установлены.
- Откройте программное обеспечение для сбора данных и установите время экспозиции на 100 мс, а усиление EMCCD на 300 (диапазон от 1 до 1 000).
- Добавьте иммерсионное масло в объектив и закрепите образец на предметном столике микроскопа.
- При включенном ярком поле или лазере с длиной волны 561 нм (~1 кВт/см2) сфокусируйте образец.
- Для визуализации Ras и других мембранных белков используйте объектив TIRF с 60-кратным апохроматом и числовой апертурой 1,49 и установите микроскоп в конфигурацию TIRF. Отрегулируйте возбуждающий лазер таким образом, чтобы он был смещен от центра при попадании в заднюю апертуру объектива TIRF; Это приводит к тому, что лазер отклоняется при достижении образца. Продолжайте регулировать лазер до тех пор, пока не будет достигнут критический угол и лазер не отразится обратно. Найдите ячейку для изображения с несколькими золотыми частицами в поле зрения. Установите область интереса, которая заключает в себе ячейку (или область внутри ячейки) и золотые частицы.
Примечание: TIRF уменьшает глубину проникновения возбуждающего лазера и уменьшает фоновый сигнал вне фокуса. Кроме того, коррекция дрейфа, вероятно, будет более точной, когда в поле зрения больше частиц золота.
- Если это возможно, включите систему автофокусировки для коррекции дрейфа образца в направлении z. В противном случае отрегулируйте фокус вручную на протяжении всего процесса съемки, если изображение выходит из фокуса.
- Начните сбор данных при выключенном лазере 405 нм и включенном лазере 561 нм (~1 кВт/см2) в случае, если уже происходит достаточная активация (обычно при высоких уровнях экспрессии). В противном случае включите лазер с длиной волны 405 нм на самой низкой заводской мощности (0,02 мВт или 0,01 Вт/см2) и постепенно увеличивайте мощность (0,1 мВт за раз) по мере необходимости, пока в кадре не будет несколько десятков молекул или около того, чтобы отдельные молекулы были хорошо разделены.
- По мере продолжения сбора данных постепенно увеличивайте мощность лазера на длине волны 405 нм, чтобы плотность пятна оставалась примерно постоянной. Примечание: При более низкой мощности возбуждения 405 нм некоторые PAmCherry1 уже могут быть активированы. По мере того, как эти молекулы фотообесцвечиваются, популяция оставшихся фотоактивируемых молекул PAmCherry1 уменьшается, что требует более высокого потока фотонов для поддержания одинаковой плотности молекул, излучающих флуоресценцию в каждом кадре.
- Продолжайте получение изображения до тех пор, пока высокая мощность 405 нм (2,5 – 10 Вт/см2) не активирует больше событий активации.
заметка: Общее время сбора зависит от уровня экспрессии и эффективности комплементации.
Таблица 1. Праймеры для линеаризации клонирования плазмид, содержащих фрагменты PAmCherry1. Клонирующие плазмиды, содержащие RN и RC, могут быть линеаризованы с помощью обратной ПЦР в точке вставки на N- или C-конце фрагментов. Последовательности перечислены от 5' до 3'.
стороны
хода
| Последовательность праймеров (от 5' до 3') |
| Клонирование плазмиды для вставки на N-конце обратной | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN на N-конечном переднем конце | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC на N-конечном конце вперед | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Клонирование плазмиды для введения в С-конце вперед | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN от C-концевого обратного | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC от C-образного конца в обратном направлении | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Таблица 2. Выступы для интересующих генов праймеров, которые соответствуют праймерам Таблицы 1.
15 пар оснований гомологии для реакции, не зависящей от лигирования, генерируются из выступов праймеров. Кроме того, вылеты включают последовательность для гибкого компоновщика (GGGGS)x2. Вместо этого к праймерам, приведенным в таблице 1, может быть добавлена гибкая последовательность линкеров. Последовательности перечислены от 5' до 3'.
порядке
| Выступы для интересующих генов праймеров (от 5' до 3') |
| N-концевая вставка RN или RC вперед | GAGCTCGGTACCATG |
| N-концевая вставка RN в обратном | ACTTCCACCTCCACCACCTC
CACCTCCCTCTCGCTTGCTCAC |
| N-контактная вставка RC обратная | ACTTCCACCTCCACCACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| Вставка С-концевого RN вперед | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| С-образный ввод RC вперед | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| С-образная вставка RN или RC обратная | GCGCCCACCCTTTTA |